Desarrollo de un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial para medir la energía mitocondrial en el campo
Summary
Diseñamos y construimos un laboratorio móvil para medir las tasas de respiración en mitocondrias aisladas de animales silvestres capturados en lugares de campo. Aquí, describimos el diseño y equipamiento de un laboratorio mitocondrial móvil y los protocolos de laboratorio asociados.
Abstract
La energética mitocondrial es un tema central en la bioquímica y fisiología animal, y los investigadores utilizan la respiración mitocondrial como métrica para investigar la capacidad metabólica. Para obtener las medidas de respiración mitocondrial, se deben utilizar muestras biológicas frescas y se debe completar todo el procedimiento de laboratorio en aproximadamente 2 h. Además, se requieren múltiples equipos especializados para realizar estos ensayos de laboratorio. Esto crea un desafío para medir la respiración mitocondrial en los tejidos de animales salvajes que viven lejos de los laboratorios de fisiología, ya que el tejido vivo no se puede conservar durante mucho tiempo después de la recolección en el campo. Además, el transporte de animales vivos a largas distancias induce estrés, lo que puede alterar la energía mitocondrial.
Este manuscrito presenta el MitoMobile de la Universidad de Auburn (AU), un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial que se puede llevar al campo y utilizar in situ para medir el metabolismo mitocondrial en tejidos recolectados de animales salvajes. Se presentan las características básicas del laboratorio móvil y los métodos paso a paso para medir las tasas de respiración mitocondrial aisladas. Además, los datos presentados validan el éxito de equipar el laboratorio móvil de fisiología mitocondrial y realizar mediciones de la respiración mitocondrial. La novedad del laboratorio móvil radica en la capacidad de conducir hasta el campo y realizar mediciones mitocondriales en los tejidos de los animales capturados in situ.
Introduction
Hasta la fecha, los estudios diseñados para medir la energía mitocondrial se han limitado a animales de laboratorio o animales capturados cerca de laboratorios de fisiología establecidos, lo que impidió a los científicos realizar estudios bioenergéticos mitocondriales en tejidos recolectados de animales durante actividades tales como migración, buceo e hibernación 1,2,3,4,5,6 . Si bien muchos investigadores han medido con éxito las tasas metabólicas basales y máximas y los gastos energéticos diarios de los animales salvajes7,8, la capacidad de los investigadores para medir el rendimiento de las mitocondrias ha seguido siendo limitada (pero ver 1,4,9). Esto se debe en parte a la necesidad de tejido fresco para aislar las mitocondrias y a una instalación de laboratorio para realizar los aislamientos dentro de aproximadamente 2 horas después de obtener el tejido fresco. Una vez que se han aislado las mitocondrias, las mediciones de la respiración mitocondrial también deben completarse dentro de ~ 1 h.
Las frecuencias respiratorias mitocondriales aisladas generalmente se realizan midiendo la concentración de oxígeno en un recipiente sellado conectado a un electrodo Clark. La teoría detrás de este método se basa en la observación básica de que el oxígeno es el último aceptor de electrones de la respiración mitocondrial durante la fosforilación oxidativa. Por lo tanto, a medida que la concentración de oxígeno disminuye durante un experimento, se supone que se produce la producción de trifosfato de adenosina (ATP)10. El oxígeno consumido es un indicador del ATP producido. Los investigadores pueden crear condiciones experimentales específicas utilizando diferentes sustratos e iniciar la respiración estimulada por difosfato de adenosina (ADP) (estado 3) mediante la adición de cantidades predeterminadas de ADP a la cámara. Después de la fosforilación del ADP exógeno a ATP, la tasa de consumo de oxígeno disminuye y se alcanza el estado 4 y se puede medir. Además, la adición de inhibidores específicos permite obtener información sobre la respiración por fuga y la respiración desacoplada10. La relación entre el estado 3 y el estado 4 determina la relación de control respiratorio (RCR), que es el indicador del acoplamiento mitocondrial global10,11. Los valores más bajos de RCR indican una disfunción mitocondrial general, mientras que los valores más altos de RCR sugieren un mayor grado de acoplamiento mitocondrial10.
Como se indicó anteriormente, la recolección de material biológico, el aislamiento mitocondrial y la medición de las tasas respiratorias deben completarse dentro de las 2 h posteriores a la obtención del tejido. Para llevar a cabo esta tarea sin transportar animales a grandes distancias a laboratorios establecidos, se construyó un laboratorio móvil de fisiología mitocondrial para llevarlo a lugares de campo donde se pueden recopilar estos datos. Un vehículo recreativo Jayco Redhawk de 2018 se convirtió en un laboratorio móvil de fisiología molecular y se llamó MitoMobile de la Universidad de Auburn (AU) (Figura 1A). Se seleccionó un vehículo recreativo debido al refrigerador, congelador, tanque de almacenamiento de agua y plomería incorporados, electricidad alimentada por baterías de 12 voltios, generador de gas, tanque de propano y sistema de autonivelación. Además, el vehículo recreativo ofrece la capacidad de permanecer en sitios remotos durante la noche para la recopilación de datos. La parte delantera del vehículo no fue alterada y proporciona los cuartos de conducción y dormitorio (Figura 1B). Se retiraron las amenidades del dormitorio previamente instaladas (cama, TV y gabinete) en la parte trasera del vehículo y la estufa.
Se instalaron estanterías de acero inoxidable hechas a medida y una encimera de cuarzo personalizada sostenida por un marco de aluminio 80/20 en lugar de las comodidades del dormitorio y la estufa (Figura 1C). Las mesas de laboratorio proporcionan un espacio adecuado para la recolección de datos (Figura 1D). Se tuvo en cuenta el consumo de energía de cada equipo (es decir, centrífuga refrigerada, cámaras de respiración mitocondrial, lectores de placas, computadoras, homogeneizadores, básculas, ultracongeladores portátiles y otros suministros generales de laboratorio). Para soportar las grandes demandas de voltaje y corriente de la centrífuga, el sistema eléctrico se actualizó al de un equipo de grado aeronáutico. Un compartimiento externo en la parte trasera del vehículo se convirtió en una bahía de almacenamiento de nitrógeno líquido, que cumple con las pautas del Departamento de Transporte de los Estados Unidos para el almacenamiento y transporte de nitrógeno líquido. Esta unidad de almacenamiento fue construida con acero inoxidable y tiene una ventilación adecuada para evitar que el gas nitrógeno en expansión se filtre en el compartimiento de pasajeros del vehículo.
Para confirmar que el laboratorio móvil se puede utilizar en estudios bioenergéticos mitocondriales, se aislaron mitocondrias y se midieron las tasas de respiración mitocondrial del músculo esquelético de las extremidades traseras de ratones domésticos silvestres (Mus musculus). Debido a que Mus musculus es un organismo modelo, las tasas de respiración mitocondrial de esta especie están bien establecidas12,13,14. Aunque estudios previos han documentado el aislamiento mitocondrial a través de la centrifugación diferencial15,16,17, a continuación se describe una breve descripción de los métodos utilizados en los métodos móviles de laboratorio de fisiología mitocondrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
El laboratorio móvil de fisiología mitocondrial permite a los investigadores aislar mitocondrias y medir las tasas de respiración mitocondrial dentro de las 2 horas posteriores a la recolección de tejido en sitios de campo remotos. Los resultados presentados en este documento sugieren que las mediciones de la respiración mitocondrial realizadas en el MitoMobile de la UA son comparables a las mediciones realizadas en un laboratorio de investigación universitario. Específicamente, los valores para el estado 3, el es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a Mark Nelms y John Tennant, del departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática de la Facultad de Ingeniería Samuel Ginn de la Universidad de Auburn, por ayudar con el equipamiento estructural y eléctrico del MitoMobile de la UA. Además, los autores agradecen la financiación para equipar el MitoMobile de la UA y la investigación de una beca de los Premios Presidenciales de Investigación Interdisciplinaria (PAIR) de la Universidad de Auburn.
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
| 2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
| 50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
| ADP | VWR | 97061-104 | |
| ATP | VWR | 700009-070 | |
| Bradford | VWR | 7065-020 | |
| Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
| EGTA | VWR | EM-4100 | |
| Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
| Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
| Glutamate | VWR | A12919 | |
| Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
| Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
| KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
| Malate | VWR | 97062-140 | |
| Mannitol | VWR | 97061-052 | |
| Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
| MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
| MOPS | VWR | 80503-004 | |
| Policeman | VWR | 470104-462 | |
| Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
| Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
| Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
| Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
| Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
| Succinate | VWR | 89230-086 | |
| Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
| Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
| Tris-HCl | VWR | 97061-258 |
References
- Toews, D. P., Mandic, M., Richards, J. G., Irwin, D. E. Migration, mitochondria, and the yellow-rumped warbler. Evolution. 68 (1), 241-255 (2014).
- Scott, G. R., Richards, J. G., Milsom, W. K. Control of respiration in flight muscle from the high-altitude bar-headed goose and low-altitude birds. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 297 (4), 1066-1074 (2009).
- Kjeld, T., et al. Oxygen conserving mitochondrial adaptations in the skeletal muscles of breath hold divers. PLoS One. 13 (9), 0201401 (2018).
- Hochachka, P., et al. Protective metabolic mechanisms during liver ischemia: transferable lessons from long-diving animals. Molecular and Cellular Biochemistry. 84 (1), 77-85 (1988).
- Muleme, H. M., Walpole, A. C., Staples, J. F. Mitochondrial metabolism in hibernation: metabolic suppression, temperature effects, and substrate preferences. Physiological and Biochemical Zoology. 79 (3), 474-483 (2006).
- Brown, J. C., Chung, D. J., Belgrave, K. R., Staples, J. F. Mitochondrial metabolic suppression and reactive oxygen species production in liver and skeletal muscle of hibernating thirteen-lined ground squirrels. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (1), 15-28 (2012).
- Daan, S., Masman, D., Groenewold, A. Avian basal metabolic rates: their association with body composition and energy expenditure in nature. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 259 (2), 333-340 (1990).
- Thompson, S. D., Nicoll, M. E. Basal metabolic rate and energetics of reproduction in therian mammals. Nature. 321 (6071), 690-693 (1986).
- Stier, A., et al. Oxidative stress and mitochondrial responses to stress exposure suggest that king penguins are naturally equipped to resist stress. Scientific Reports. 9 (1), 8545 (2019).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. Third edition. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Mowry, A. V., Donoviel, Z. S., Kavazis, A. N., Hood, W. R. Mitochondrial function and bioenergetic trade-offs during lactation in the house mouse (Mus musculus). Ecology and Evolution. 7 (9), 2994-3005 (2017).
- Zhang, Y., et al. High activity before breeding improves reproductive performance by enhancing mitochondrial function and biogenesis. Journal of Experimental Biology. 221 (7), (2018).
- Zhang, Y., Humes, F., Almond, G., Kavazis, A. N., Hood, W. R. A mitohormetic response to pro-oxidant exposure in the house mouse. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 314 (1), 122-134 (2018).
- Boutagy, N. E., et al. Isolation of mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53217 (2015).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. Isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (121), e55251 (2017).
- Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. Mitochondrial isolation from skeletal muscle. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (49), e2452 (2011).
- Pravdic, D., et al. Complex I and ATP synthase mediate membrane depolarization and matrix acidification by isoflurane in mitochondria. European Journal of Pharmacology. 690 (1-3), 149-157 (2012).
- Brooks, S. P., Lampi, B. J., Bihun, C. G. The influence of euthanasia methods on rat liver metabolism. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 38 (6), 19-24 (1999).
- Overmyer, K. A., Thonusin, C., Qi, N. R., Burant, C. F., Evans, C. R. Impact of anesthesia and euthanasia on metabolomics of mammalian tissues: studies in a C57BL/6J mouse model. PLoS One. 10 (2), 0117232 (2015).
- Kuzmiak, S., Glancy, B., Sweazea, K. L., Willis, W. T. Mitochondrial function in sparrow pectoralis muscle. Journal of Experimental Biology. 215 (12), 2039-2050 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Figueiredo, P. A., et al. Impact of lifelong sedentary behavior on mitochondrial function of mice skeletal muscle. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 64 (9), 927-939 (2009).
- Scheibye-Knudsen, M., Quistorff, B. Regulation of mitochondrial respiration by inorganic phosphate; comparing permeabilized muscle fibers and isolated mitochondria prepared from type-1 and type-2 rat skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 105 (2), 279-287 (2009).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).
- Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric oxidative phosphorylation assessment in saponin-permeabilized cardiac fibers. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2431 (2011).
- Gaviraghi, A., et al. Mechanical permeabilization as a new method for assessment of mitochondrial function in insect tissues. Mitochondrial Medicine. Vol. 2: Assessing Mitochonndria. , 67-85 (2021).
- Hedges, C. P., Wilkinson, R. T., Devaux, J. B. L., Hickey, A. J. R. Hymenoptera flight muscle mitochondrial function: Increasing metabolic power increases oxidative stress. Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology. 230, 115-121 (2019).
- Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. Mitochondria: isolation, structure and function. Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).
- Picard, M., et al. Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods. PLoS One. 6 (3), 18317 (2011).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3 (6), 965 (2008).
- Abolins, S., et al. The comparative immunology of wild and laboratory mice, Mus musculus domesticus. Nature Communications. 8, 14811 (2017).
- Swart, J. A. The wild animal as a research animal. Journal of Agricultural and Environmental Ethics. 17 (2), 181-197 (2004).
- Calisi, R. M., Bentley, G. E. Lab and field experiments: Are they the same animal. Hormones and Behavior. 56 (1), 1-10 (2009).
