Vi designade och konstruerade ett mobilt laboratorium för att mäta andningsfrekvensen i isolerade mitokondrier hos vilda djur som fångats på fältplatser. Här beskriver vi design och utrustning av ett mobilt mitokondrielaboratorium och tillhörande laboratorieprotokoll.
Mitokondriell energi är ett centralt tema inom djurbiokemi och fysiologi, med forskare som använder mitokondriell andning som ett mått för att undersöka metabolisk förmåga. För att få mått på mitokondriell andning måste färska biologiska prover användas, och hela laboratorieproceduren måste slutföras inom cirka 2 timmar. Dessutom krävs flera delar av specialutrustning för att utföra dessa laboratorieanalyser. Detta skapar en utmaning för att mäta mitokondriell andning i vävnader från vilda djur som lever långt från fysiologiska laboratorier eftersom levande vävnad inte kan bevaras särskilt länge efter insamling i fält. Att transportera levande djur över långa sträckor orsakar dessutom stress, vilket kan förändra mitokondriernas energi.
Detta manuskript introducerar Auburn University (AU) MitoMobile, ett mobilt mitokondriellt fysiologilaboratorium som kan tas in i fält och användas på plats för att mäta mitokondriell metabolism i vävnader som samlats in från vilda djur. Det mobila laboratoriets grundläggande egenskaper och steg-för-steg-metoder för att mäta isolerade mitokondriella andningsfrekvenser presenteras. Dessutom validerar de data som presenteras framgången med att utrusta det mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriet och göra mitokondriella andningsmätningar. Det nya med det mobila laboratoriet ligger i möjligheten att köra till fältet och utföra mitokondriella mätningar på vävnader från djur som fångats på plats.
Hittills har studier som är utformade för att mäta mitokondriell energi begränsats till försöksdjur eller djur som fångats nära etablerade fysiologiska laboratorier, vilket uteslutit forskare från att utföra mitokondriella bioenergetiska studier i vävnader som samlats in från djur under sådana aktiviteter som migration, dykning och övervintring 1,2,3,4,5,6 . Medan många forskare framgångsrikt har mätt de basala och maximala ämnesomsättningshastigheterna och den dagliga energiförbrukningen hos vilda djur 7,8, har forskarnas kapacitet att mäta mitokondriernas prestanda förblivit begränsad (se 1,4,9). Detta beror delvis på behovet av färsk vävnad för att isolera mitokondrier och en laboratorieanläggning för att utföra isoleringarna inom cirka 2 timmar efter att den färska vävnaden erhållits. När mitokondrierna har isolerats bör även mätningarna av mitokondriernas andning slutföras inom ~1 timme.
Isolerade mitokondriella andningshastigheter utförs vanligtvis genom att mäta syrekoncentrationen i en förseglad behållare ansluten till en Clark-elektrod. Teorin bakom denna metod bygger på den grundläggande observationen att syre är den sista elektronacceptorn för mitokondriell andning under oxidativ fosforylering. Därför, när syrekoncentrationen sjunker under ett experiment, antas det att produktion av adenosintrifosfat (ATP) sker10. Förbrukat syre är en proxy för producerad ATP. Forskare kan skapa specifika experimentella förhållanden med hjälp av olika substrat och initiera adenosindifosfat (ADP)-stimulerad andning (tillstånd 3) genom att tillsätta förutbestämda mängder ADP till kammaren. Efter fosforyleringen av den exogena ADP till ATP minskar syreförbrukningen och tillstånd 4 uppnås och kan mätas. Dessutom gör tillsatsen av specifika inhibitorer det möjligt att få information om läckagerespiration och okopplad respiration10. Förhållandet mellan tillstånd 3 och tillstånd 4 bestämmer andningskontrollförhållandet (RCR), som är indikatorn för den totala mitokondriella kopplingen10,11. Lägre värden på RCR indikerar övergripande mitokondriell dysfunktion, medan högre RCR-värden tyder på en större grad av mitokondriell koppling10.
Som tidigare nämnts måste insamlingen av biologiskt material, mitokondriell isolering och mätning av andningshastigheter slutföras inom 2 timmar efter att vävnaden erhållits. För att utföra denna uppgift utan att transportera djur över stora avstånd till etablerade laboratorier, konstruerades ett mobilt mitokondriefysiologiskt laboratorium för att tas till fältplatser där dessa data kan samlas in. En Jayco Redhawk fritidsbil från 2018 omvandlades till ett mobilt laboratorium för molekylär fysiologi och döptes till Auburn University (AU) MitoMobile (figur 1A). Ett fritidsfordon valdes på grund av den inbyggda kylen, frysen, vattentanken och VVS, el som drivs av 12-voltsbatterier, gasgenerator, propantank och självnivellerande system. Dessutom ger fritidsfordonet möjlighet att stanna på avlägsna platser över natten för datainsamling. Fordonets front har inte ändrats och utgör kör- och sovplats (figur 1B). Tidigare installerade sovrumsbekvämligheter (säng, TV och skåp) i den bakre delen av fordonet och spishällen togs bort.
Specialtillverkade hyllor i rostfritt stål och en anpassad bänkskiva i kvarts som stöds av 80/20 aluminiumram installerades i stället för sovrumsbekvämligheterna och spishällen (Figur 1C). Laboratoriebänkarna ger tillräckligt med utrymme för datainsamling (figur 1D). Hänsyn togs till energiförbrukningen för varje utrustning (t.ex. kylcentrifug, mitokondriella andningskammare, plattläsare, datorer, homogenisatorer, vågar, bärbar ultrafrys och andra allmänna laboratorietillbehör). För att klara centrifugens stora spännings- och strömbehov uppgraderades det elektriska systemet till utrustning av flygplanskvalitet. Ett externt fack i den bakre delen av fordonet omvandlades till ett förvaringsfack för flytande kväve, som uppfyller USA:s transportdepartements riktlinjer för lagring och transport av flytande kväve. Denna förvaringsenhet är konstruerad av rostfritt stål och har ordentlig ventilation för att förhindra att expanderande kvävgas läcker in i fordonets passagerarutrymme.
För att bekräfta att det mobila laboratoriet kan användas i mitokondriella bioenergetiska studier isolerades mitokondrier och mitokondriell respirationsfrekvens från vildhärledda husmöss (Mus musculus) bakbensskelettmuskulatur mättes. Eftersom Mus musculus är en modellorganism är mitokondriernas andningsfrekvens för denna art väletablerad12,13,14. Även om tidigare studier har dokumenterat mitokondriell isolering via differentiell centrifugering15,16,17, beskrivs nedan en kort översikt över de metoder som används i de mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriemetoderna.
Det mobila mitokondriella fysiologiska laboratoriet gör det möjligt för forskare att isolera mitokondrier och mäta mitokondriell andningsfrekvens inom 2 timmar efter vävnadsinsamling på avlägsna fältplatser. Resultaten som presenteras här tyder på att mätningar av mitokondriell andning som görs i AU MitoMobile är jämförbara med mätningar som görs i ett universitets forskningslaboratorium. Specifikt är värdena för tillstånd 3, tillstånd 4 och RCR för vildhärledda Mus musculus som presenter…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Mark Nelms och John Tennant från avdelningen för elektro- och datateknik vid Samuel Ginn College of Engineering vid Auburn University för att ha hjälpt till med den strukturella och elektriska utrustningen av AU MitoMobile. Dessutom erkänner författarna finansieringen för att utrusta AU MitoMobile och forskning från ett Auburn University Presidential Awards for Interdisciplinary Research (PAIR) -anslag.
1.7 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-294 | |
2.0 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-298 | |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 21009-681 | Nalgene Oak Ridge Centrifuge Tube |
ADP | VWR | 97061-104 | |
ATP | VWR | 700009-070 | |
Bradford | VWR | 7065-020 | |
Clear 96 well plate | VWR | 82050-760 | Greiner Bio-One |
Dounce homogenizer | VWR | 22877-284 | Corning |
EGTA | VWR | EM-4100 | |
Filter paper | Included with Hansatech OxyGraph | ||
Free-fatty acid BSA | VWR | 89423-672 | |
Glucose | VWR | BDH8005-500G | |
Glutamate | VWR | A12919 | |
Hamilton Syringes | VWR | 60373-985 | Gaslight 1700 Series Syringes |
Hansatech OxyGraph | Hansatech Instruments Ltd | No Catalog Number, but can be found under Products –> Electrode Control Units | |
KH2PO4 | VWR | 97062-350 | |
Malate | VWR | 97062-140 | |
Mannitol | VWR | 97061-052 | |
Membrane | Included with Hansatech OxyGraph | ||
MgCl2 | VWR | 97063-152 | |
MOPS | VWR | 80503-004 | |
Policeman | VWR | 470104-462 | |
Polytron | Thomas Scientific | 11090044 | |
Potassium chloride (KCl) | VWR | 97061-566 | |
Protease | VWR | 97062-366 | Trypsin is commonly used; however, other proteases can be used. |
Pyruvic acid | VWR | 97061-448 | |
Sodium Dithionite | VWR | AA33381-22 | |
Succinate | VWR | 89230-086 | |
Sucrose | VWR | BDH0308-500G | |
Tris-Base | VWR | 97061-794 | |
Tris-HCl | VWR | 97061-258 |