Visualizzazione dinamica plus-end dei microtubuli nel modello della malattia di Huntington basato sui fibroblasti cutanei primari umani
Summary
Questo protocollo è dedicato alla visualizzazione plus-end dei microtubuli mediante trasfezione della proteina EB3 per studiarne le proprietà dinamiche in coltura cellulare primaria. Il protocollo è stato implementato su fibroblasti cutanei primari umani ottenuti da pazienti affetti da Malattia di Huntington.
Abstract
La trasfezione con una proteina marcatore di interesse marcata fluorescente in combinazione con la videomicroscopia time-lapse è un metodo classico di studio delle proprietà dinamiche del citoscheletro. Questo protocollo offre una tecnica per la trasfezione dei fibroblasti primari umani, che può essere difficile a causa delle specifiche delle condizioni di coltivazione delle cellule primarie. Inoltre, il mantenimento della proprietà dinamica del citoscheletro richiede un basso livello di trasfezione per ottenere un buon rapporto segnale-rumore senza causare la stabilizzazione dei microtubuli. È importante adottare misure per proteggere le cellule dallo stress indotto dalla luce e dallo sbiadimento del colorante fluorescente. Nel corso del nostro lavoro, abbiamo testato diversi metodi e protocolli di trasfezione, nonché diversi vettori per selezionare la migliore combinazione di condizioni adatte per gli studi sui fibroblasti primari umani. Abbiamo analizzato i video time-lapse risultanti e calcolato le dinamiche dei microtubuli utilizzando ImageJ. La dinamica delle estremità positive dei microtubuli nelle diverse parti cellulari non è simile, quindi abbiamo diviso l’analisi in sottogruppi: la regione centrosoma, la lamella e la coda dei fibroblasti. In particolare, questo protocollo può essere utilizzato per l’analisi in vitro della dinamica del citoscheletro in campioni di pazienti, consentendo il passo successivo verso la comprensione delle dinamiche del vario sviluppo della malattia.
Introduction
La malattia di Huntington (HD) è una patologia neurodegenerativa incurabile causata da una mutazionina del gene che codifica per la proteina cacciatina (HTT). L’HTT è principalmente associata a vescicole e microtubuli ed è probabilmente coinvolta nei processi di trasporto dipendenti dai microtubuli1,2. Per studiare l’influenza dell’HTT mutante sulla dinamica dei microtubuli, abbiamo utilizzato la visualizzazione in vitro della proteina EB3, che regola le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i plus-end in crescita. Per caricare EB3 etichettato in modo fluorescente nei fibroblasti della pelle umana, è stata applicata la trasfezione del plasmide. Abbiamo utilizzato la coltura primaria di fibroblasti ottenuta dalla biopsia cutanea dei pazienti MH per questo studio.
La mutazione nel gene della proteina HTT porta all’allungamento del tratto poliglutammina3. HTT ha un ruolo in tali processi cellulari come l’endocitosi4, il trasporto cellulare1,2, la degradazione delle proteine5, ecc. Parte sostanziale di questi processi coinvolge vari elementi del citoscheletro cellulare, compresi i microtubuli.
Le cellule primarie umane sono il modello migliore per riprodurre il più fedelmente possibile gli eventi che si verificano nelle cellule dei pazienti. Per creare tali modelli, è necessario isolare le cellule dal materiale bioptico umano (ad esempio, da campioni chirurgici). La linea cellulare primaria risultante è adatta per studiare la patogenesi utilizzando vari metodi genetici, biochimici, molecolari e di biologia cellulare. Inoltre, le colture cellulari primarie umane fungono da precursore per la creazione di varie colture transdifferenziate e transgeniche6.
Tuttavia, a differenza delle colture cellulari immortalizzate, lo svantaggio significativo delle cellule primarie è la loro limitata capacità di passaggio. Pertanto, si consiglia di utilizzare le cellule nella fase dei primi passaggi (fino a 15). Le culture più vecchie degenerano molto rapidamente, perdendo le loro proprietà uniche. Pertanto, le cellule primarie appena ottenute dovrebbero essere mantenute congelate per la conservazione a lungo termine.
Le colture cellulari primarie sono suscettibili alle condizioni di coltivazione. Pertanto, spesso richiedono approcci unici e ottimizzazione delle condizioni di crescita. In particolare, i fibroblasti primari della pelle umana utilizzati nei nostri esperimenti sono esigenti sul substrato. Quindi, abbiamo usato vari rivestimenti aggiuntivi (ad esempio, gelatina o fibronectina) a seconda del tipo di esperimento.
Il citoscheletro cellulare determina la forma, la mobilità e la locomozione cellulare. La dinamica del citoscheletro è cruciale per molti processi intracellulari sia nell’interfase che nella mitosi. In particolare, il citoscheletro polimerizzato dalla tubulina, sono strutture altamente dinamiche e polari, consentendo il trasporto intracellulare diretto mediato da proteine motorie. Le estremità dei microtubuli sono in costante riarrangiamento, le loro fasi di assemblaggio si alternano alle fasi di smontaggio, e questo comportamento è chiamato “instabilità dinamica”7,8,9. Varie proteine associate spostano l’equilibrio della reazione di polimerizzazione, portando alla formazione del polimero o alla formazione del monomero proteico. L’aggiunta di subunità di tubulina avviene principalmente all’estremità superiore dei microtubuli10. La famiglia delle proteine end-binding (EB) è composta da tre membri: EB1, EB2 ed EB3. Servono come proteine plus-end-tracking (+TIP) e regolano le proprietà dinamiche dei microtubuli legando e stabilizzando i loro plus-end increscita 11.
Molti studi utilizzano la microiniezione o la trasfezione di tubulina marcata con molecole fluorescenti con imaging time-lapse e analisi video per visualizzare i microtubuli in vitro. Questi metodi potrebbero essere invasivi e dannosi per le cellule, in particolare le cellule umane primarie. Il passo più impegnativo è trovare le condizioni per la trasfezione cellulare. Abbiamo cercato di raggiungere il più alto livello possibile di trasfezione senza influire sulla vitalità e sulla morfologia delle cellule native. Questo studio applica il metodo classico per studiare le differenze nella dinamica dei microtubuli nei fibroblasti cutanei di donatori sani e pazienti con malattia di Huntington.
Protocol
Representative Results
Discussion
Risultati di migliore qualità per l’analisi dinamica dei microtubuli possono essere ottenuti da immagini microscopiche di alta qualità. È importante osservare tutte le condizioni necessarie per l’imaging time-lapse delle cellule viventi e regolare correttamente i parametri di imaging. L’uso di speciali piatti di coltura cellulare con un fondo di vetro (piatti confocali) è importante, poiché il vetro ha un diverso indice di rifrazione della luce rispetto alla plastica. Anche lo spessore del vetro e la sua uniformità…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore della Federazione Russa, sovvenzione n. 075-15-2019-1669 (trasfezione dei fibroblasti), dalla Russian Science Foundation, sovvenzione n. 19-15-00425 (tutti gli altri lavori sulla coltivazione di fibroblasti in vitro). È stato parzialmente supportato dal programma di sviluppo dell’Università statale di Mosca Lomonosov PNR5.13 (imaging e analisi). Gli autori riconoscono il supporto del Nikon Center of Excellence presso l’A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Vogliamo offrire i nostri ringraziamenti speciali a Ekaterina Taran per la sua assistenza nella recitazione vocale. Gli autori ringraziano anche Pavel Belikov per il suo aiuto con l’editing video. Le figure nel manoscritto sono state create con BioRender.com.
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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