ヒト原発性皮膚線維芽細胞に基づくハンチントン病モデルにおける微小管プラスエンドダイナミクスの可視化
Summary
このプロトコルは、EB3タンパク質トランスフェクションによる微小管プラスエンドビジュアライゼーションに専念し、一次細胞培養における動的特性を研究しています。このプロトコルは、ハンチントン病患者から得られたヒト原発性皮膚線維芽細胞に実施された。
Abstract
蛍光標識マーカータンパク質とタイムラプスビデオ顕微鏡との組み合わせでのトランスフェクションは、細胞骨格の動的特性を研究する古典的な方法です。このプロトコルは、ヒトの原発性線維芽細胞トランスフェクションの技術を提供し、一次細胞培養条件の詳細のために困難であり得る。さらに、細胞骨格の動的特性の維持は微小管の安定化を引き起こすことなく良好な信号対雑音比を得るためにトランスフェクションの低レベルを必要とします。光によるストレスや蛍光色素の退色から細胞を保護する対策を講じるのが重要です。私たちの研究の過程で、我々は人間の一次線維芽細胞研究に適した条件の最良の組み合わせを選択するために、異なるトランスフェクション方法とプロトコルだけでなく、異なるベクターをテストしました。得られたタイムラプス動画を解析し、ImageJを用いて微小管ダイナミクスを計算した。異なる細胞部分における微小管のプラスエンドのダイナミクスは似ていないので、我々は分析をサブグループ(中心領域、ラメラ、線維芽細胞の尾)に分けました。特に、このプロトコルは、患者のサンプルにおける細胞骨格動態の インビトロ 分析に使用することができ、様々な疾患の発症のダイナミクスを理解するための次のステップを可能にする。
Introduction
ハンチントン病(HD)は、タンパチンチンタンパク質(HTT)をコードする変異遺伝子によって引き起こされる不治の神経変性病理である。HTT は、主に小胞と微小管に関連しており、おそらく微小管依存輸送プロセス1,2に関与している。微小管ダイナミクスに対する変異HTTの影響を研究するために、成長するプラスエンドを結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節するEB3タンパク質のインビトロビジュアライゼーションを用いた。蛍光標識されたEB3をヒト皮膚線維芽細胞にロードするために、プラスミドトランスフェクションを適用した。この研究では、HD患者の皮膚生検から得られた原発性線維芽細胞培養を用いた。
HTTタンパク質遺伝子の変異は、ポリグルタミン管3の伸びにつながる。HTTは、エンドサイトーシス4、細胞輸送1、2、タンパク質分解5、等のような細胞プロセスにおいて役割を有する。これらのプロセスの大部分は、微小管を含む細胞細胞骨格の様々な要素を含む。
ヒトの初等細胞は、患者細胞で起こる事象を可能な限り密接に再現するのに最適なモデルです。このようなモデルを作成するには、ヒト生検材料(例えば、外科サンプルから)から細胞を分離する必要があります。得られた一次細胞株は、種々の遺伝的、生化学的、分子的、および細胞生物学の方法を用いて病原論を研究するのに適している。また、ヒト一次細胞培養は、様々なトランスフォー分化およびトランスジェニック培養を作成するための前駆体として機能する6。
しかし、不死化細胞培養とは対照的に、初代細胞の重大な欠点は、その限られた通過能力である。したがって、初期の通路段階(最大15)で細胞を使用することをお勧めします。古い文化は非常に迅速に退化し、そのユニークな特性を失います。したがって、新たに得られた一次細胞は、長期保存のために凍結しておくべきである。
一次細胞培養は、培養条件に影響を受けやすい。したがって、多くの場合、独自のアプローチと増大する条件の最適化が必要です。特に、我々の実験で使用されるヒト皮膚原発性線維芽細胞は、基質に要求されている。そこで、実験の種類に応じて、様々な追加コーティング(例えばゼラチンやフィブロネクチン)を用いた。
細胞骨格は、細胞の形状、移動度、および移動を決定します。細胞骨格の動態は、多くの細胞内プロセスにおいて、相間および有糸分裂の両方において極めて重要である。特に、チューブリンから重合した細胞骨格は、高い動的かつ極性構造であり、運動タンパク質媒介指向細胞内輸送を可能にする。微小管の末端は一定の再配置で、その組立相は分解相と交互に行われ、この動作は「動的不安定性」7、8、9と呼ばれる。様々な関連タンパク質は、重合反応の平衡をシフトし、ポリマー形成またはタンパク質モノマー形成のいずれかに導く。管状サブユニットの添加は、主に微小管10のプラスエンドで起こる。エンド結合(EB)タンパク質ファミリーは、EB1、EB2、EB3の3つのメンバーで構成されています。それらはプラスエンドトラッキングタンパク質(+TIP)として機能し、成長するプラスエンド11を結合して安定化させることによって微小管の動的特性を調節する。
多くの研究では、蛍光分子標識チューブリンマイクロインジェクションまたはトランスフェクションを使用して、タイムラプスイメージングとビデオ分析を行い、 インビトロで微小管を視覚化する。これらの方法は、細胞、特に初等ヒト細胞に侵襲的で有害である可能性があります。最も困難なステップは、細胞トランスフェクションの条件を見つけることです。生存率やネイティブ細胞形態に影響を与えることなく、可能な限り最高レベルのトランスフェクションに到達しようとしました。この研究は、健康なドナーとハンチントン病患者の皮膚線維芽細胞における微小管ダイナミクスの違いを研究するために古典的な方法を適用する。
Protocol
Representative Results
Discussion
微小管のダイナミクス解析の品質の向上は、高品質の顕微鏡画像から得ることができます。生きている細胞のタイムラプスイメージングに必要なすべての条件を観察し、イメージングパラメータを正しく調整することが重要です。ガラスはプラスチックとは異なる屈折率を有するため、ガラス底部(共焦点皿)を備えた特殊な細胞培養皿を使用することは重要である。ガラスの厚さと領域全体?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ロシア連邦の科学と高等教育省によって資金提供されました, 助成金0. 075-15-2019-1669 (線維芽細胞のトランスフェクション), ロシア科学財団によって, 助成金第19-15-00425 (vitroで線維芽細胞の栽培に関するすべての他の作品).これは、ロモノソフモスクワ州立大学開発プログラムPNR5.13(イメージングと分析)によって部分的にサポートされました。著者らは、A.N.ベロゼルスキー物理化学生物学研究所のニコン・センター・オブ・エクセレンスの支援を認めている。エカテリーナ・タランに、声優の支援をしてくれた方に、特別な感謝を申し上げたいと思っています。著者らはまた、ビデオ編集に彼の助けを借りてパヴェル・ベリコフに感謝します。原稿の中の数字は BioRender.com で作成されました。
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
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