İnsan Primer Cilt Fibroblastlarına Dayalı Huntington Hastalık Modelinde Mikrotübül Artı-Uç Dinamikleri Görselleştirmesi
Summary
Bu protokol, birincil hücre kültüründeki dinamik özelliklerini incelemek için EB3 protein transfeksiyonu ile mikrotübül artı-uç görselleştirmesine adanmıştır. Protokol, Huntington hastalığı hastalarından elde edilen insan primer deri fibroblastları üzerinde uygulandı.
Abstract
Zaman atlamalı video mikroskopisi ile birlikte ilgi çekici floresan etiketli bir işaret proteini ile transfection, sitoskeletonun dinamik özelliklerini incelemek için klasik bir yöntemdir. Bu protokol, birincil hücre ekim koşullarının özellikleri nedeniyle zor olabilen insan primer fibroblast transfeksiyonu için bir teknik sunmaktadır. Ek olarak, sitoskeleton dinamik özellik bakımı, mikrotübül stabilizasyonuna neden olmadan iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için düşük düzeyde transfeksiyon gerektirir. Hücreleri ışık kaynaklı stresten ve floresan boya solmasından korumak için önlemler almak önemlidir. Çalışmalarımız boyunca, insan birincil fibroblast çalışmalarına uygun koşulların en iyi kombinasyonunu seçmek için farklı transfeksiyon yöntemlerini ve protokollerini ve farklı vektörleri test ettik. Ortaya çıkan hızlandırılmış videoları analiz ettik ve ImageJ kullanarak mikrotübül dinamiklerini hesapladık. Mikrotübüllerin farklı hücre parçalarındaki artı uçlarının dinamikleri benzer değildir, bu nedenle analizi alt gruplara ayırdık – merkezkant bölge, lamel ve fibroblastların kuyruğu. Özellikle, bu protokol hasta örneklerinde sitoskeleton dinamiklerinin in vitro analizi için kullanılabilir ve çeşitli hastalık gelişiminin dinamiklerini anlamaya yönelik bir sonraki adımı sağlar.
Introduction
Huntington hastalığı (HD), mutasyonin gen kodlamasıhuntingtin proteini (HTT) nedeniyle tedavi edilemez bir nörodejeneratif patolojidir. HTT öncelikle veziklinler ve mikrotübüllerle ilişkilidir ve muhtemelen mikrotübül bağımlı taşıma süreçlerinde yer almaktadır1,2. Mutant HTT’nin mikrotübül dinamikleri üzerindeki etkisini incelemek için, büyüyen artı uçları bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerini düzenleyen EB3 proteininin in vitro görselleştirmesini kullandık. Floresan etiketli EB3’ü insan derisi fibroblastlarına yüklemek için plazmid transfeksiyon uygulandı. Bu çalışma için HD hastalarının cilt biyopsisinden elde edilen primer fibroblast kültürünü kullandık.
HTT protein geninde mutasyon poliglutamin sisteminin uzaması3. HTT, endositoz4,hücre taşıma1,2,protein bozulması5,vb. Bu süreçlerin önemli bir kısmı, mikrotübüller de dahil olmak üzere hücre sitoskeletonunun çeşitli unsurlarını içerir.
İnsan birincil hücreleri, hasta hücrelerinde meydana gelen olayları mümkün olduğunca yakından yeniden üretmek için en iyi modeldir. Bu tür modeller oluşturmak için, hücreleri insan biyopsi malzemesinden (örneğin cerrahi örneklerden) izole etmek gerekir. Ortaya çıkan primer hücre hattı, çeşitli genetik, biyokimyasal, moleküler ve hücre biyolojisi yöntemlerini kullanarak patogenez çalışmak için uygundur. Ayrıca, insan birincil hücre kültürleri çeşitli transdifferentiated ve transgenik kültürler oluşturmak için bir öncü olarak hizmet vermektedir6.
Bununla birlikte, ölümsüzleştirilmiş hücre kültürlerinin aksine, birincil hücrelerin önemli dezavantajı sınırlı geçiş kapasiteleridir. Bu nedenle, hücreleri erken geçiş aşamasında (15’e kadar) kullanmanızı öneririz. Eski kültürler çok hızlı bir şekilde dejenere lanır ve benzersiz özelliklerini kaybeder. Bu nedenle, yeni elde edilen birincil hücreler uzun süreli depolama için dondurulmalıdır.
Birincil hücre kültürleri yetiştirme koşullarına karşı hassastır. Bu nedenle, genellikle benzersiz yaklaşımlar ve büyüme koşullarının optimizasyonu gerektirirler. Özellikle, deneylerimizde kullanılan insan derisi birincil fibroblastları substrat üzerinde talep ediyor. Bu nedenle, deney türüne bağlı olarak çeşitli ek kaplamalar (örneğin jelatin veya fibronektin) kullandık.
Hücre sitoskeleton hücre şeklini, hareketliliğini ve hareketliliğini belirler. Sitoskeletonun dinamikleri hem interfaz hem de mitozda birçok hücre içi süreç için çok önemlidir. Özellikle, tübulinden polimerize edilen sitoskeleton, motor protein aracılı hücre içi taşımayı sağlayan son derece dinamik ve polar yapılardır. Mikrotübüllerin uçları sürekli yeniden düzenlenir, montaj aşamaları sökme aşamalarıyla değişir ve bu davranışa “dinamik kararsızlık”7,8,9denir. Çeşitli ilişkili proteinler polimerizasyon reaksiyonunun dengesini değiştirerek polimer oluşumuna veya protein monomer oluşumuna yol açtı. Tübulin alt ünüllerinin eklenmesi esas olarak mikrotübüllerin artı ucunda meydana gelir10. Son bağlayıcı (EB) protein ailesi üç üyeden oluşur: EB1, EB2 ve EB3. Artı uç izleme proteinleri (+TIP’ ler) görevi gösterirler ve büyüyen artı uçlarını bağlayarak ve stabilize ederek mikrotübüllerin dinamik özelliklerinidüzenlerler 11.
Birçok çalışma, mikrotübülleri in vitroolarak görselleştirmek için zaman atlamalı görüntüleme ve video analizi ile floresan molekül etiketli tübulin mikroenjeksiyonu veya transfeksiyonu kullanır. Bu yöntemler istilacı ve hücrelere, özellikle birincil insan hücrelerine zararlı olabilir. En zorlu adım hücre transfeksiyon için koşulları bulmaktır. Canlılığı ve doğal hücre morfolojisini etkilemeden mümkün olan en yüksek transfeksiyon seviyesine ulaşmaya çalıştık. Bu çalışma, sağlıklı donörlerin ve Huntington hastalığı olan hastaların cilt fibroblastlarındaki mikrotübül dinamiklerindeki farklılıkları incelemek için klasik yöntemi uygular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrotübüllerin dinamik analizi için daha kaliteli sonuçlar yüksek kaliteli mikroskobik görüntülerden elde edilebilir. Canlı hücrelerin hızlandırılmış görüntülemesi için gerekli tüm koşulları gözlemlemek ve görüntüleme parametrelerini doğru ayarlamak önemlidir. Cam tabanlı özel hücre kültürü yemekleri (konfokal yemekler) kullanmak önemlidir, çünkü cam plastikten farklı bir kırılma indeksine sahiptir. Camın kalınlığı ve tüm alanı üzerindeki homojenliği de son derece öneml…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Rusya Federasyonu Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı tarafından finanse edildi, Hibe No. 075-15-2019-1669 (fibroblastların transfeksiyon), Rusya Bilim Vakfı tarafından hibe 19-15-00425 (fibroblast in vitroekimi ile ilgili diğer tüm çalışmalar). Lomonosov Moskova Devlet Üniversitesi Geliştirme programı PNR5.13 (görüntüleme ve analiz) tarafından kısmen desteklendi. Yazarlar, A. N. Belozersky Fiziko-Kimyasal Biyoloji Enstitüsü’ndeki Nikon Mükemmeliyet Merkezi’nin desteğini kabul ediyor. Seslendirme konusundaki yardımları için Ekaterina Taran’a özel teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz. Yazarlar ayrıca Pavel Belikov’a video düzenleme konusundaki yardımları için teşekkür etti. El yazmasındaki figürler BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington’s disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus. Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).
- Steffan, J. S., et al. The Huntington’s disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington’s disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J. Microtubule polymerization dynamics. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O’Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. 생화학. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
