1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
뇌에 상주하는 대식세포인 미세아교세포는 환경 스트레스에 대한 반응과 뇌 항상성을 포함한 여러 기능의 기본입니다. 미세아교세포는 광범위한 활성화 표현형을 채택할 수 있습니다. 또한, 전 염증성 표현형을지지하는 미세 아교 세포는 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애와 관련이 있습니다. 시험관 내 연구는 특정 세포 유형에서 잠재적 인 치료 전략을 평가하기위한 연구에 널리 사용됩니다. 이러한 맥락에서 일차 소교세포 배양을 사용하여 시험관 내에서 미세아교세포 활성화 및 신경염증을 연구하는 것이 소교세포 세포주 또는 줄기세포 유래 미세아교세포보다 더 관련이 있습니다. 그러나 일부 1 차 배양의 사용은 재현성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아 새끼에서 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 제안합니다. mRNA 발현 정량화 및 Cy3-비드 식세포 분석에 의한 4시간 및 24시간 후 여러 자극을 사용한 미세아교세포 활성화가 여기에서 입증됩니다. 현재의 연구는 청소년 발달 단계에서 생리 학적으로 관련된 미세 아교 세포를 분리하기위한 쉽게 재현 가능한 기술을 제공 할 것으로 기대된다.
서론
미세아교세포는 초기 배아 발달 동안 신경 상피로 이동하는 난황낭의 적혈구 생성 전구체에서 유래한 중추신경계에 상주하는 대식세포 유사 세포입니다1. 면역 기능 외에도 신경 발달 중, 특히 시냅스 형성, 신경 항상성 및 수초화2에 중요한 역할을합니다. 성인기에 미세아교세포는 환경을 지속적으로 스캔하기 위해 긴 세포 과정을 발달시킵니다. 뇌 손상이나 뇌 질환과 같은 항상성 파열의 경우, 미세 아교 세포는 형태 학적 모양을 변경하여 아메보이드 모양을 채택하고 손상된 부위로 이동하여 많은 세포 보호 또는 세포 독성 인자를 증가 및 방출 할 수 있습니다. 미세아교세포는 발달 단계와 3,4,5 지속되는 부상 유형에 따라 이질적인 활성화 상태를 갖습니다. 이 연구에서 이러한 활성화 상태는 크게 세 가지 표현형으로 분류됩니다 : 전 염증 / 식세포, 항 염증 및 면역 조절, 실제로는 상황이 더 복잡 할 가능성이 있음을 명심하십시오6.
생체 내 소교세포....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
프로토콜은 승인되었고 모든 동물은 Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France)의 기관 지침에 따라 처리되었습니다. 6웰, 12웰 또는 96웰 플레이트로 분할된 P8에서 24개의 OF1 마우스 새끼(수컷과 암컷 모두)의 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리가 제시됩니다. 실험 작업은 멸균 상태를 유지하기 위해 후드 하에서 수행되었습니다.
1. 분리 및 세포 배양을 위한 멸균 용액의 제조
- 시판되는 50x 용액에서Ca 2 + 및 Mg2+ (HBSS-/-)가없는 1x 행크스 균형 소금 용액 (HBSS) 10mL를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).
- 시판되는 조직 해리 키트를 사용하여 표 1 에 제공된 조성에 따라 해리 혼합물을 제조한다( 재료 표 참조).
- 시판되는 10x 용액에서Ca2+ 및 Mg 2+(HBSS+/+)가 포함된 1x HBSS200mL를 준비합니다. ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
미세아교세포는 환경적 문제(외상, 독성 분자, 염증)4,5,6,34에 노출될 때 활성화되는 CNS 상주 대식세포입니다(그림 3A). 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 일반적으로 이러한 환경적 문제와 관련된 세포 자율 메커니즘을 평가하고 약리학적 또는 유전적 조작 후 활성화 상태를 특성화하는 데 사용됩니다. 여기에서는 자기 결합 비드를 사용하여 어린 단계에서 일차 미세아교세포를 분리하는 접근법이 제시됩니다.
시험관 내에서 소교세포 활성화에 대한 쉬운 판독은 전염증성 표현형(Cd86, Nos2, Ptgs2, Tnf) 또는 항염증 표현형(Cd206.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
현재 연구는 자기적으로 분류된 CD11b+ 세포를 사용하는 1차 소교세포 배양을 제시합니다. 소교세포 기능 평가(RT-qPCR 및 식세포 분석) 외에도 미세아교세포 배양 순도도 측정되었습니다.
고전적인 미세아교세포 세포 배양은 일반적으로 P1 또는 P2 설치류 신생아 뇌에서 생성되고 최소 10일 동안 성상교세포와 공동 배양됩니다. 그런 다음 미세아교세포를 오비탈 셰이커를 사용하여 기계적으로 분리합니다. 시험관 내에서 미세 아교 세포를 분리하고 배양하는 방법은 신생아쥐 1990 대 40,41의 뇌에서 처음으로 설명되었습니다. 그 이후로 활성화/휴지기 미세아교세포 또는 전염증성/항염증성 미세아교세포와 같은 미세아교세포 표현형을 분석하는 데 널리 사용되었습니다. 또한, 이 실험은 미세아교세포를 뉴런과 공동 배양된 신경독성 세포로 정의하는 데 기본이 되었습니다. 그러.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
감사의 글
피규어는 바이오렌더를 사용하여 생성되었습니다. 연구는 Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation de France, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, Investissement d' Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS 및 Investissement d' Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.의 추가 보조금을 지원합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 안티 마우스 ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| 안티 마우스 CD11b BV421 | 소니 생명 공학 | 1106255 | |
| 안티 마우스 CD45 BV510 | 소니 생명 공학 | 1115690 | |
| 안티 마우스 CX3CR1 PE Cy7 | 소니 생명 공학 | 1345075 | |
| 안티 마우스 NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| 안티 마우스 O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 투과화 키트 | BD Biosciences | 554655 | |
| 소 혈청 알부민 | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| 컨포칼 현미경 | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell 배양 12웰 플레이트, 평평한 바닥 + 뚜껑 | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell 배양 96웰 플레이트, 평평한 바닥 + 뚜껑 | Dutscher | 353072 | |
| Falcon 튜브 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc 차단 시약(마우스 CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| 형광 현미경 | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C 튜브(4 x 25 튜브) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR 그린 슈퍼믹스 | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA 합성 | Bio-rad | 1708890 | |
| 라텍스 비드, 아민 수정 폴리스티렌, 형광 레드 | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| 지방다당류 (LPS)로부터; 대장균 O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| 대식세포-SFM 무혈청 매체 | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA 스톡 솔루션 | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μ m), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| 마우스 IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| 마우스 IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| 마우스 IL1 베타 | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 분리기 | Miltenyi Biotec | ||
| 신경 조직 해리 키트 - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish - 100 x 20 mm | Dutscher | ||
| Pé 니실린-스트렙토마이신 (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| 재조합 마우스 IFN-감마 단백질 | R& D 시스템 | 485-MI | |
| 재조합 마우스 IL-10 단백질 | R& D 시스템 | 417-ML | |
| 재조합 마우스 IL-4 단백질 | R& D 시스템 | 404-ML | |
| RIPA 버퍼 | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| 생존 프로브(FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
참고문헌
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain functio....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
