العزل المغناطيسي للخلايا الدبقية الصغيرة من فأر حديث الولادة لمزارع الخلايا الأولية
Summary
تستخدم مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية بشكل شائع لتقييم الجزيئات الجديدة المضادة للالتهابات. يصف البروتوكول الحالي طريقة قابلة للتكرار وذات صلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مغناطيسيا عن صغار حديثي الولادة.
Abstract
تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة ، باعتبارها بلاعم مقيمة في الدماغ ، أساسية للعديد من الوظائف ، بما في ذلك الاستجابة للإجهاد البيئي وتوازن الدماغ. يمكن أن تتبنى الخلايا الدبقية الصغيرة مجموعة كبيرة من الأنماط الظاهرية للتنشيط. علاوة على ذلك ، ترتبط الخلايا الدبقية الصغيرة التي تؤيد النمط الظاهري المؤيد للالتهابات بكل من اضطرابات النمو العصبي والاضطرابات التنكسية العصبية. تستخدم الدراسات في المختبر على نطاق واسع في البحث لتقييم الاستراتيجيات العلاجية المحتملة في أنواع معينة من الخلايا. في هذا السياق ، تعد دراسة تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والالتهاب العصبي في المختبر باستخدام مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية أكثر أهمية من خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية. ومع ذلك ، قد يعاني استخدام بعض الثقافات الأولية من نقص التكاثر. يقترح هذا البروتوكول طريقة قابلة للتكرار وذات صلة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مغناطيسيا عن صغار حديثي الولادة. يتم هنا توضيح التنشيط الدبقي الصغير باستخدام العديد من المحفزات بعد 4 ساعات و 24 ساعة عن طريق القياس الكمي لتعبير mRNA ومقايسة البلعمة Cy3-bead. من المتوقع أن يوفر العمل الحالي تقنية قابلة للتكرار بسهولة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية عن مراحل نمو الأحداث.
Introduction
الخلايا الدبقية الصغيرة هي الخلايا الشبيهة بالبلاعم المقيمة في الجهاز العصبي المركزي المشتقة من السلائف الكريات الحمر لكيس الصفار التي تهاجر إلى الظهارة العصبية أثناء التطور الجنيني المبكر1. بصرف النظر عن وظائف المناعة ، فإنها تلعب أيضا دورا مهما أثناء النمو العصبي ، خاصة في تكوين المشابك ، والتوازن العصبي ، والميالين2. في مرحلة البلوغ ، تطور الخلايا الدبقية الصغيرة عمليات خلوية طويلة لمسح البيئة بشكل مستمر. في حالة تمزق التوازن مثل إصابة الدماغ أو أمراض الدماغ ، يمكن للخلايا الدبقية الصغيرة تغيير مظهرها المورفولوجي لتبني شكل أميبي ، والهجرة إلى المنطقة المصابة ، وزيادة وإطلاق العديد من العوامل الواقية للخلايا أو السامة للخلايا. الخلايا الدبقية الصغيرة لها حالات تنشيط غير متجانسة اعتمادا على مرحلة نموها ونوع الإصابة التي لحقتبها 3،4،5. في هذه الدراسة ، يتم تصنيف حالات التنشيط هذه على نطاق واسع إلى ثلاثة أنماط ظاهرية مختلفة: مؤيدة للالتهابات / البلعمة ، ومضادة للالتهابات ، ومنظمة مناعية ، مع الأخذ في الاعتبار أنه في الواقع ، من المرجح أن يكون الوضع أكثر تعقيدا6.
يمكن أن تكون الدراسة في الجسم الحي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة وفحص استراتيجيات الحماية العصبية في المراحل المبكرة من نمو الدماغ صعبة بسبب (1) هشاشة الحيوانات قبل الفطام و (2) انخفاض عدد الخلايا الدبقية الصغيرة. لذلك تستخدم الدراسات في المختبر على الخلايا الدبقية الصغيرة على نطاق واسع للسمية7،8،9 ، واستراتيجيات الحماية العصبية5،10،11،12،13،14 ، والثقافات المشتركة15،16،17،18،19،20،21 . يمكن أن تستخدم الدراسات في المختبر إما خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة أو الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية أو ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية. كل هذه الأساليب لها مزايا وعيوب ، ويعتمد الاختيار على السؤال البيولوجي الأولي. فوائد استخدام مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية هي الخلفية الوراثية المتجانسة ، والتاريخ الخالي من مسببات الأمراض ، والتحكم في الوقت الذي يتم فيه تحفيز الخلايا الدبقية الصغيرة بعد موت الحيوان22.
على مر السنين، تم تطوير طرق مختلفة (قياس التدفق الخلوي، أو الاهتزاز، أو وضع العلامات المغناطيسية) لزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية من القوارض، سواء حديثي الولادة أو البالغين 23،24،25،26،27،28،29. في العمل الحالي، يتم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة من صغار الفئران حديثي الولادة باستخدام تقنية فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا الموصوفة سابقا باستخدام CD11b25،27،29 المضاد للفأر المغلف بالميكروبيدات. CD11b هو مستقبل إنتغرين يتم التعبير عنه على سطح الخلايا النخاعية ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. عندما لا يكون هناك تحد التهابي داخل الدماغ ، فإن جميع خلايا CD11b + تقريبا هي الخلايا الدبقية الصغيرة30. بالمقارنة مع الطرق الأخرى المنشورة سابقا 23،24،25،26،27،28،29 ، يوازن البروتوكول الحالي بين تحليلات التنشيط الفوري للخلايا الدبقية الصغيرة خارج الجسم الحي وزراعة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية الشائعة في المختبر. وبالتالي ، فإن الخلايا الدبقية الصغيرة (1) معزولة في يوم ما بعد الولادة (P) 8 دون إزالة المايلين ، (2) مستنبتة بدون مصل ، و (3) تتعرض إما ل siRNA و miRNA و / أو مركب دوائي و / أو محفزات التهابية بعد 48 ساعة فقط من عزل الدماغ. كل جانب من هذه الجوانب الثلاثة يجعل البروتوكول الحالي مناسبا وسريعا. بادئ ذي بدء ، يسمح استخدام الخلايا الدبقية الصغيرة لدى الأطفال بالحصول على خلايا ديناميكية وتفاعلية قابلة للحياة في الثقافة دون الحاجة إلى خطوة إضافية لإزالة الميالين يمكن أن تعدل تفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر. يهدف البروتوكول الحالي إلى الاقتراب قدر الإمكان من البيئة الفسيولوجية للخلايا الدبقية الصغيرة. في الواقع ، لا تواجه الخلايا الدبقية الصغيرة مصلا أبدا ، ولا يتطلب هذا البروتوكول استخدام المصل أيضا. علاوة على ذلك ، فإن تعريض الخلايا الدبقية الصغيرة في وقت مبكر من 48 ساعة بعد الثقافة يمنعهم من فقدان كلياتهم الفسيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم العمل الحالي ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية باستخدام خلايا CD11b + المصنفة مغناطيسيا. بالإضافة إلى التقييم الوظيفي الدبقي الصغير (RT-qPCR والمقايسات البلعمية) ، تم أيضا تحديد نقاء ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة.
عادة ما يتم إنشاء مزارع الخلايا الدبقية الصغيرة الكلاس?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إنشاء الأشكال باستخدام BioRender. يتم تمويل البحث من قبل Inserm ، جامعة باريس ، Horizon 2020 (PREMSTEM-874721) ، مؤسسة فرنسا ، مؤسسة ARSEP ، مؤسسة البحوث حول سيرفو ، مؤسسة نعمة موناكو ، ومنحة إضافية من Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
