Isolement magnétique de cellules microgliales de souris nouveau-née pour des cultures de cellules primaires
Summary
Les cultures primaires de microglies sont couramment utilisées pour évaluer de nouvelles molécules anti-inflammatoires. Le présent protocole décrit une méthode reproductible et pertinente pour isoler magnétiquement la microglie des nouveau-nés.
Abstract
La microglie, en tant que macrophages résidant dans le cerveau, est fondamentale pour plusieurs fonctions, y compris la réponse au stress environnemental et l’homéostasie cérébrale. La microglie peut adopter un large spectre de phénotypes d’activation. De plus, les microglies qui endossent le phénotype pro-inflammatoire sont associées à la fois à des troubles neurodéveloppementaux et neurodégénératifs. Les études in vitro sont largement utilisées dans la recherche pour évaluer les stratégies thérapeutiques potentielles dans des types cellulaires spécifiques. Dans ce contexte, l’étude de l’activation microgliale et de la neuroinflammation in vitro à l’aide de cultures microgliales primaires est plus pertinente que les lignées cellulaires microgliales ou la microglie dérivée de cellules souches. Cependant, l’utilisation de certaines cultures primaires pourrait souffrir d’un manque de reproductibilité. Ce protocole propose une méthode reproductible et pertinente d’isolement magnétique de la microglie des nouveau-nés. L’activation microgliale utilisant plusieurs stimuli après 4 h et 24 h par quantification de l’expression de l’ARNm et un dosage phagocytaire à billes de Cy3 est démontrée ici. Les travaux actuels devraient fournir une technique facilement reproductible pour isoler les microglies physiologiquement pertinentes des stades de développement juvéniles.
Introduction
Les microglies sont les cellules macrophages résidentes du système nerveux central dérivées des précurseurs érythropoïétiques du sac vitellin qui migrent vers le neuroépithélium au cours du développement embryonnaire précoce1. Outre leurs fonctions immunitaires, ils jouent également un rôle important au cours du développement neurologique, en particulier pour la synaptogenèse, l’homéostasie neuronale et la myélinisation2. À l’âge adulte, les microglies développent de longs processus cellulaires pour scanner l’environnement en continu. En cas de ruptures d’homéostasie telles qu’une lésion cérébrale ou une maladie cérébrale, les microglies peuvent modifier leur aspect morphologique pour adopter une forme amiboïde, migrer vers la zone lésée, augmenter et libérer de nombreux facteurs cytoprotecteurs ou cytotoxiques. Les microglies ont des états d’activation hétérogènes en fonction de leur stade de développement et du type de lésion subie 3,4,5. Dans cette étude, ces états d’activation sont largement classés en trois phénotypes différents : pro-inflammatoire/phagocytaire, anti-inflammatoire et immuno-régulateur, en gardant à l’esprit qu’en réalité, la situation est susceptible d’être plus complexe6.
L’étude in vivo de l’activation microgliale et le dépistage des stratégies neuroprotectrices aux premiers stades du développement du cerveau peuvent être difficiles en raison (1) de la fragilité des animaux avant le sevrage et (2) du faible nombre de cellules microgliales. Par conséquent, les études in vitro sur la microglie sont largement utilisées pour la toxicité 7,8,9, les stratégies neuroprotectrices 5,10,11,12,13,14 et les co-cultures 15,16,17,18,19,20,21 . Les études in vitro peuvent utiliser soit des lignées cellulaires microgliales, soit des microglies dérivées de cellules souches, soit une culture microgliale primaire. Toutes ces approches ont des avantages et des inconvénients, et le choix dépend de la question biologique initiale. Les avantages de l’utilisation de cultures microgliales primaires sont le fond génétique homogène, l’histoire exempte d’agents pathogènes et le contrôle du moment où les microglies sont stimulées après la mort de l’animal22.
Au fil des ans, différentes méthodes (cytométrie en flux, agitation ou marquage magnétique) ont été développées pour cultiver la microglie primaire de rongeurs, nouveau-nés et adultes 23,24,25,26,27,28,29. Dans le présent travail, l’isolement de la microglie à partir de bébés nouveau-nés de souris est effectué à l’aide de la technologie de tri cellulaire activée magnétique décrite précédemment à l’aide de CD11b25,27,29 anti-souris enrobé de microbilles. CD11b est un récepteur intégrine exprimé à la surface des cellules myéloïdes, y compris la microglie. Lorsqu’il n’y a pas de défi inflammatoire dans le cerveau, presque toutes les cellules CD11b+ sont des cellules microgliales30. Par rapport à d’autres méthodes publiées précédemment 23,24,25,26,27,28,29, le présent protocole équilibre les analyses d’activation microgliale ex vivo immédiates et la culture microgliale primaire in vitro commune. Ainsi, les microglies sont (1) isolées au jour postnatal (P)8 sans élimination de la myéline, (2) cultivées sans sérum, et (3) exposées soit à des siRNA, des miARN, des composés pharmacologiques et/ou des stimuli inflammatoires seulement 48 h après l’isolement cérébral. Chacun de ces trois aspects rend le protocole actuel pertinent et rapide. Tout d’abord, l’utilisation de la microglie pédiatrique permet d’obtenir des cellules viables dynamiques et réactives en culture sans nécessiter une étape de démyélinisation supplémentaire qui pourrait potentiellement modifier la réactivité microgliale in vitro. Le présent protocole vise à se rapprocher le plus possible de l’environnement physiologique de la microglie. En effet, les microglies ne rencontrent jamais de sérum, et ce protocole ne nécessite pas non plus l’utilisation de sérum. De plus, exposer les microglies dès 48 h après la culture les empêche de perdre leurs facultés physiologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les travaux actuels présentent une culture cellulaire microgliale primaire utilisant des cellules CD11b+ triées magnétiquement. En plus de l’évaluation fonctionnelle microgliale (RT-qPCR et tests phagocytaires), la pureté de la culture microgliale a également été déterminée.
Les cultures classiques de cellules microgliales sont généralement générées à partir du cerveau du nouveau-né de rongeurs P1 ou P2 et co-culture avec des astrocytes pendant au moins 10 jours. Les microgl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les figurines ont été créées à l’aide de BioRender. La recherche est financée par l’Inserm, l’Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), la Fondation de France, la Fondation ARSEP, la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, la Fondation Grace de Monaco, et une subvention complémentaire d’Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS et Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
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