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신경과학

Magnetische Isolierung von Mikrogliazellen aus neugeborener Maus für primäre Zellkulturen

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/62964
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1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48,Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care,APHP-Sorbonne university

Summary

Primäre Mikrogliakulturen werden häufig verwendet, um neue entzündungshemmende Moleküle zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen.

Abstract

Mikroglia, als hirnresidente Makrophagen, sind grundlegend für mehrere Funktionen, einschließlich der Reaktion auf Umweltstress und Gehirnhomöostase. Mikroglia können ein großes Spektrum von Aktivierungsphänotypen annehmen. Darüber hinaus sind Mikroglia, die den proinflammatorischen Phänotyp unterstützen, sowohl mit neurologischen Entwicklungsstörungen als auch mit neurodegenerativen Störungen assoziiert. In-vitro-Studien werden häufig in der Forschung eingesetzt, um mögliche therapeutische Strategien in bestimmten Zelltypen zu bewerten. In diesem Zusammenhang ist die Untersuchung der Mikrogliaaktivierung und Neuroinflammation in vitro unter Verwendung primärer Mikrogliakulturen relevanter als Mikrogliazelllinien oder Stammzell-abgeleitete Mikroglia. Die Verwendung einiger Primärkulturen könnte jedoch unter mangelnder Reproduzierbarkeit leiden. Dieses Protokoll schlägt eine reproduzierbare und relevante Methode zur magnetischen Isolierung von Mikroglia aus neugeborenen Welpen vor. Mikroglia-Aktivierung mit mehreren Stimuli nach 4 h und 24 h durch mRNA-Expressionsquantifizierung und einen Cy3-Bead Phagozyten-Assay wird hier demonstriert. Die aktuellen Arbeiten sollen eine leicht reproduzierbare Technik zur Isolierung physiologisch relevanter Mikroglia aus juvenilen Entwicklungsstadien liefern.

Introduction

Mikroglia sind die im zentralen Nervensystem ansässigen Makrophagen-ähnlichen Zellen, die von erythropoetischen Vorläufern des Dottersacks abstammen, die während der frühen Embryonalentwicklung in das Neuroepithel wandern1. Neben ihren Immunitätsfunktionen spielen sie auch eine wichtige Rolle während der Neuroentwicklung, insbesondere bei der Synaptogenese, neuronalen Homöostase und Myelinisierung2. Im Erwachsenenalter entwickeln Mikroglia lange zelluläre Prozesse, um die Umgebung kontinuierlich zu scannen. Im Falle von Homöostaserupturen wie Hirnverletzungen oder Gehirnerkrankungen können Mikroglia ihr morphologisches Aussehen verändern, um eine amöboide Form anzunehmen, in den verletzten Bereich zu wandern, viele zytoprotektive oder zytotoxische Faktoren zu erhöhen und freizusetzen. Mikroglia haben heterogene Aktivierungszustände, abhängig von ihrem Entwicklungsstadium und der Art der erlittenen Verletzung 3,4,5. In dieser Studie werden diese Aktivierungszustände grob in drei verschiedene Phänotypen eingeteilt: entzündungsfördernd/phagozytisch, entzündungshemmend und immunregulatorisch, wobei zu berücksichtigen ist, dass die Situation in Wirklichkeit wahrscheinlich komplexer ist6.

Die Untersuchung der In-vivo-Mikrogliaaktivierung und das Screening auf neuroprotektive Strategien in frühen Stadien der Gehirnentwicklung kann aufgrund (1) der Zerbrechlichkeit der Tiere vor dem Absetzen und (2) der geringen Anzahl von Mikrogliazellen eine Herausforderung darstellen. Daher werden In-vitro-Studien an Mikroglia häufig für Toxizität 7,8,9, neuroprotektive Strategien5,10,11,12,13,14 und Kokulturen 15,16,17,18,19,20,21 verwendet. . In-vitro-Studien können entweder Mikroglia-Zelllinien, Stammzell-abgeleitete Mikroglia oder primäre Mikroglia-Kultur verwenden. Alle diese Ansätze haben Vor- und Nachteile, und die Wahl hängt von der anfänglichen biologischen Frage ab. Die Vorteile der Verwendung primärer Mikrogliakulturen sind der homogene genetische Hintergrund, die pathogenfreie Geschichte und die Kontrolle des Zeitpunkts, zu dem die Mikroglia nach dem Tiertod stimuliert werden22.

Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Methoden (Durchflusszytometrie, Schütteln oder magnetische Markierung) entwickelt, um primäre Mikroglia von Nagetieren zu kultivieren, sowohl Neugeborenen als auch Erwachsenen 23,24,25,26,27,28,29. In der vorliegenden Arbeit wird die Mikroglia-Isolierung von Maus-Neugeborenen-Welpen unter Verwendung der zuvor beschriebenen magnetisch aktivierten Zellsortiertechnologie unter Verwendung von mikroperlenbeschichtetem Anti-Maus-CD11b25,27,29 durchgeführt. CD11b ist ein Integrinrezeptor, der an der Oberfläche myeloischer Zellen, einschließlich Mikroglia, exprimiert wird. Wenn es keine entzündliche Herausforderung im Gehirn gibt, sind fast alle CD11b + -Zellen Mikroglia30. Im Vergleich zu anderen zuvor veröffentlichten Methoden 23,24,25,26,27,28,29 gleicht das vorliegende Protokoll sofortige Ex-vivo-Mikroglia-Aktivierungsanalysen und gängige primäre In-vitro-Mikrogliakulturen aus. So werden Mikroglia (1) am postnatalen Tag (P)8 ohne Myelinentfernung isoliert, (2) ohne Serum kultiviert und (3) erst 48 h nach der Gehirnisolierung entweder siRNA, miRNA, pharmakologischen Verbindungen und/oder entzündlichen Reizen ausgesetzt. Jeder dieser drei Aspekte macht das aktuelle Protokoll relevant und schnell. Erstens ermöglicht die Verwendung von pädiatrischen Mikroglia die Gewinnung dynamischer und reaktiver lebensfähiger Zellen in Kultur, ohne dass ein zusätzlicher Demyelinisierungsschritt erforderlich ist, der möglicherweise die Mikroglia-Reaktivität in vitro verändern könnte. Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, der physiologischen Umgebung von Mikroglia so nahe wie möglich zu kommen. Tatsächlich treffen Mikroglia nie auf Serum, und dieses Protokoll erfordert auch nicht die Verwendung von Serum. Darüber hinaus verhindert die Freilegung von Mikroglia bereits 48 Stunden nach der Kultur, dass sie ihre physiologischen Fähigkeiten verlieren.

Protocol

Das Protokoll wurde genehmigt und alle Tiere wurden gemäß den institutionellen Richtlinien des Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankreich) behandelt. Die magnetische Isolierung von Mikroglia aus den Gehirnen von 24 OF1-Mauswelpen (sowohl männlich als auch weiblich) bei P8, unterteilt in 6-Well-, 12-Well- oder 96-Well-Platten, wird vorgestellt. Die experimentelle Arbeit wurde unter einer Haube durchgeführt, um sterile Bedingungen aufrechtzuerhalten. <st…

Representative Results

Mikroglia ist der ZNS-residente Makrophag, der aktiviert wird, wenn er Umweltproblemen (Trauma, toxische Moleküle, Entzündungen) ausgesetzt ist4,5,6,34 (Abbildung 3A). In-vitro-Studien an Mikroglia werden häufig verwendet, um zellautonome Mechanismen im Zusammenhang mit diesen Umweltherausforderungen zu bewerten und den Aktivierungszustand nach pharmako…

Discussion

Die aktuelle Arbeit präsentiert eine primäre Mikrogliazellkultur mit magnetisch sortierten CD11b+-Zellen. Neben der mikroglialen Funktionsbewertung (RT-qPCR und phagozytäre Assays) wurde auch die Reinheit der Mikrogliakultur bestimmt.

Klassische Mikroglia-Zellkulturen werden üblicherweise aus P1- oder P2-Nagetier-Neugeborenengehirn und Co-Kultur mit Astrozyten für mindestens 10 Tage erzeugt. Mikroglia werden dann mechanisch mit einem Orbitalschüttler getrennt. Die Methode zur Isolierung …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Figuren wurden mit BioRender erstellt. Die Forschung wird von Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco und einem zusätzlichen Zuschuss von Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS und Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E. finanziert.

Materials

Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388
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References

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