בידוד מגנטי של תאים מיקרוגליאליים מעכבר ניאונאט עבור תרביות תאים ראשוניים
Summary
תרביות מיקרוגליה ראשוניות משמשות בדרך כלל להערכת מולקולות נוגדות דלקת חדשות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים.
Abstract
מיקרוגליה, כמקרופאגים תושבי המוח, הם חיוניים למספר תפקודים, כולל תגובה ללחץ סביבתי והומאוסטזיס מוחי. מיקרוגליה יכולה לאמץ ספקטרום גדול של פנוטיפים של הפעלה. יתר על כן, מיקרוגליה התומכת בפנוטיפ מרובה דלקת קשורה הן להפרעות נוירו-התפתחותיות והן להפרעות נוירודגנרטיביות. מחקרים במבחנה נמצאים בשימוש נרחב במחקר להערכת אסטרטגיות טיפוליות פוטנציאליות בסוגי תאים ספציפיים. בהקשר זה חקר הפעלה מיקרוגליאלית ודלקת עצבית במבחנה באמצעות תרביות מיקרוגליאליות ראשוניות רלוונטי יותר מאשר קווי תאים מיקרוגליאליים או מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע. עם זאת, השימוש בכמה תרבויות ראשוניות עלול לסבול מחוסר שכפול. פרוטוקול זה מציע שיטה ניתנת לשחזור ורלוונטית לבידוד מגנטי של מיקרוגליה מגורים יילודים. הפעלה מיקרוגליאלית באמצעות מספר גירויים לאחר 4 שעות ו-24 שעות על ידי כימות ביטוי mRNA ובדיקה פאגוציטית של חרוזי Cy3 מודגמת כאן. העבודה הנוכחית צפויה לספק טכניקה הניתנת לשחזור בקלות לבידוד מיקרוגליה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית משלבי התפתחות צעירים.
Introduction
מיקרוגליה (Microglia) הם תאים דמויי מקרופאגים של מערכת העצבים המרכזית, שמקורם במבשרים אריתרופוייטיים של שק החלמון הנודדים לנוירואפיתל במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת1. מלבד תפקודי החסינות שלהם, הם גם ממלאים תפקיד משמעותי במהלך התפתחות עצבית, במיוחד עבור סינפטוגנזה, הומאוסטזיס עצבי ומיאלינציה2. בבגרות, מיקרוגליה מפתחת תהליכים תאיים ארוכים כדי לסרוק את הסביבה ברציפות. במקרה של קרעים הומאוסטזיס כגון פגיעה מוחית או מחלת מוח, מיקרוגליה יכולה לשנות את המראה המורפולוגי שלהם כדי לאמץ צורה אמבואידית, לנדוד לאזור הפגוע, להגדיל ולשחרר גורמים ציטולוגיים או ציטוטוקסיים רבים. למיקרוגליה יש מצבי הפעלה הטרוגניים בהתאם לשלב ההתפתחותי שלהם ולסוג הפציעהשספג 3,4,5. במחקר זה, מצבי הפעלה אלה מסווגים באופן נרחב לשלושה פנוטיפים שונים: פרו-דלקתיים/פאגוציטיים, נוגדי דלקת ואימונו-רגולטוריים, תוך התחשבות בכך שבמציאות, המצב צפוי להיות מורכב יותר6.
חקר ההפעלה המיקרוגליאלית in vivo וסינון אחר אסטרטגיות הגנה עצבית בשלבים מוקדמים של התפתחות המוח יכול להיות מאתגר בשל (1) שבריריותם של בעלי חיים לפני הגמילה ו-(2) המספר הנמוך של תאים מיקרוגליאליים. לכן מחקרים במבחנה על מיקרוגליה נמצאים בשימוש נרחב לרעילות 7,8,9, אסטרטגיות הגנה עצבית5,10,11,12,13,14, ותרביות משותפות 15,16,17,18,19,20,21 . מחקרים במבחנה יכולים להשתמש בקווי תאים מיקרוגליאליים, במיקרוגליה שמקורה בתאי גזע או בתרבית מיקרוגליה ראשונית. לכל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות, והבחירה תלויה בשאלה הביולוגית הראשונית. היתרונות של שימוש בתרביות מיקרוגליה ראשוניות הם הרקע הגנטי ההומוגני, היסטוריה נטולת פתוגנים ושליטה בזמן שבו המיקרוגליה מגורה לאחר מות בעלי חיים22.
במהלך השנים פותחו שיטות שונות (ציטומטריה של זרימה, טלטול או תיוג מגנטי) לגידול מיקרוגליה ראשונית ממכרסמים, הן יילודים והן בוגרים 23,24,25,26,27,28,29. בעבודה הנוכחית, בידוד מיקרוגליה מגורי עכברים מבוצע באמצעות טכנולוגיית מיון תאים המופעלים על ידי מגנט שתוארה קודם לכן באמצעות CD11b 25,27,29 מצופה מיקרובאד נגד עכברים. CD11b הוא קולטן אינטגרין המתבטא על פני השטח של תאים מיאלואידים, כולל מיקרוגליה. כאשר אין אתגר דלקתי במוח, כמעט כל תאי CD11b+ הם מיקרוגליה30. בהשוואה לשיטות אחרות שפורסמו בעבר 23,24,25,26,27,28,29, הפרוטוקול הנוכחי מאזן ניתוחי הפעלה מיקרוגליאליים מיידיים ex vivo ותרבית מיקרוגליאלית ראשונית נפוצה במבחנה. לפיכך, מיקרוגליה (1) מבודדת ביום שלאחר הלידה (P)8 ללא הסרת מיאלין, (2) מבודדת ללא סרום, ו-(3) נחשפת ל-siRNA, miRNA, תרכובת פרמקולוגית ו/או גירויים דלקתיים רק 48 שעות לאחר בידוד המוח. כל אחד משלושת ההיבטים הללו הופך את הפרוטוקול הנוכחי לרלוונטי ומהיר. ראשית, השימוש במיקרוגליה ילדים מאפשר קבלת תאים בני קיימא דינמיים ותגובתיים בתרבית ללא צורך בצעד נוסף של דה-מיאלינציה שעשוי לשנות את תגובתיות המיקרוגליה במבחנה. הפרוטוקול הנוכחי נועד להתקרב ככל האפשר לסביבה הפיזיולוגית של המיקרוגליה. ואכן, מיקרוגליה לעולם אינה נתקלת בסרום, וגם פרוטוקול זה אינו דורש שימוש בסרום. יתר על כן, חשיפת מיקרוגליה כבר 48 שעות לאחר התרבית מונעת מהם לאבד את יכולותיהם הפיזיולוגיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
העבודה הנוכחית מציגה תרבית תאים מיקרוגליאלית ראשונית באמצעות תאי CD11b+ ממוינים מגנטית. בנוסף להערכה התפקודית המיקרוגליאלית (RT-qPCR ומבחני פאגוציטים), נקבע גם טוהר התרבית המיקרוגליאלית.
תרביות תאי מיקרוגליה קלאסיות נוצרות בדרך כלל ממוח ילודים של מכרסם P1 או P2 ומתרבית משותפת עם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הדמויות נוצרו באמצעות BioRender. המחקר ממומן על ידי Inserm, אוניברסיטת פריז, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, ומענק נוסף מ- Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS and Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.
Materials
| Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| Anti mouse CD11b BV421 | Sony Biotechnology | 1106255 | |
| Anti mouse CD45 BV510 | Sony Biotechnology | 1115690 | |
| Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 | Sony Biotechnology | 1345075 | |
| Anti mouse NeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| anti mouse O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit | BD Biosciences | 554655 | |
| Bovine Serum Albumin | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Confocal microscope | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| Fluorescence microscope | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| Macrophage-SFM serum-free medium | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA Stock Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| Mouse IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| Mouse IgG2a PE Cy7 | Sony Biotechnology | 2601265 | |
| Mouse IL1 beta | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 Column Blocks | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 Separator | Miltenyi Biotec | ||
| Neural Tissue Dissociation Kit – Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| Recombinant Mouse IFN-gamma Protein | R&D System | 485-MI | |
| Recombinant Mouse IL-10 Protein | R&D System | 417-ML | |
| Recombinant Mouse IL-4 Protein | R&D System | 404-ML | |
| RIPA Buffer | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| Viability probe (FVS780) | BD Biosciences | 565388 |
References
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
- Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
- Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
- Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
- Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
- Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
- Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
- Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
- Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
- Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
- Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
- Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
- Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
- Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
- You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
- Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
- Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
- Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
- Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
- Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
- Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
- Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
- Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
- Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
- Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
- Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
- Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
- Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
- Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
- Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
- Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
- Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
- Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
- Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
- Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
- Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
- Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
- Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
- Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
- Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).
