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신경과학

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/62964
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1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48,Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care,APHP-Sorbonne university

Summary

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

Abstract

뇌에 상주하는 대식세포인 미세아교세포는 환경 스트레스에 대한 반응과 뇌 항상성을 포함한 여러 기능의 기본입니다. 미세아교세포는 광범위한 활성화 표현형을 채택할 수 있습니다. 또한, 전 염증성 표현형을지지하는 미세 아교 세포는 신경 발달 및 신경 퇴행성 장애와 관련이 있습니다. 시험관 내 연구는 특정 세포 유형에서 잠재적 인 치료 전략을 평가하기위한 연구에 널리 사용됩니다. 이러한 맥락에서 일차 소교세포 배양을 사용하여 시험관 내에서 미세아교세포 활성화 및 신경염증을 연구하는 것이 소교세포 세포주 또는 줄기세포 유래 미세아교세포보다 더 관련이 있습니다. 그러나 일부 1 차 배양의 사용은 재현성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신생아 새끼에서 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 제안합니다. mRNA 발현 정량화 및 Cy3-비드 식세포 분석에 의한 4시간 및 24시간 후 여러 자극을 사용한 미세아교세포 활성화가 여기에서 입증됩니다. 현재의 연구는 청소년 발달 단계에서 생리 학적으로 관련된 미세 아교 세포를 분리하기위한 쉽게 재현 가능한 기술을 제공 할 것으로 기대된다.

Introduction

미세아교세포는 초기 배아 발달 동안 신경 상피로 이동하는 난황낭의 적혈구 생성 전구체에서 유래한 중추신경계에 상주하는 대식세포 유사 세포입니다1. 면역 기능 외에도 신경 발달 중, 특히 시냅스 형성, 신경 항상성 및 수초화2에 중요한 역할을합니다. 성인기에 미세아교세포는 환경을 지속적으로 스캔하기 위해 긴 세포 과정을 발달시킵니다. 뇌 손상이나 뇌 질환과 같은 항상성 파열의 경우, 미세 아교 세포는 형태 학적 모양을 변경하여 아메보이드 모양을 채택하고 손상된 부위로 이동하여 많은 세포 보호 또는 세포 독성 인자를 증가 및 방출 할 수 있습니다. 미세아교세포는 발달 단계와 3,4,5 지속되는 부상 유형에 따라 이질적인 활성화 상태를 갖습니다. 이 연구에서 이러한 활성화 상태는 크게 세 가지 표현형으로 분류됩니다 : 전 염증 / 식세포, 항 염증 및 면역 조절, 실제로는 상황이 더 복잡 할 가능성이 있음을 명심하십시오6.

생체 내 소교세포 활성화를 연구하고 뇌 발달 초기 단계에서 신경 보호 전략을 스크리닝하는 것은 (1) 이유 전 동물의 취약성과 (2) 소교세포 수가 적기 때문에 어려울 수 있습니다. 따라서 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 독성 7,8,9, 신경 보호 전략 5,10,11,12,13,14 및 공동 배양 15,16,17,18,19,20,21에 널리 사용됩니다. . 시험관 내 연구는 소교세포주, 줄기세포 유래 미세아교세포 또는 1차 미세아교세포 배양을 사용할 수 있습니다. 이러한 모든 접근법에는 장점과 단점이 있으며 선택은 초기 생물학적 질문에 달려 있습니다. 1차 미세아교세포 배양을 사용하는 이점은 균질한 유전적 배경, 병원체가 없는 이력 및 동물 사망 후 미세아교세포가 자극되는 시간의 제어입니다22.

수년에 걸쳐, 설치류, 신생아 및 성인 23,24,25,26,27,28,29 모두로부터 1 차 미세 아교 세포를 배양하기위한 다양한 방법 (유세포 분석, 진탕 또는 자기 표지)이 개발되었습니다. 본 연구에서, 마우스 신생아 새끼로부터의 미세아교세포 분리는 마이크로비드-코팅된 항-마우스 CD11b25,27,29를 사용하여 이전에 기술된 자기-활성화 세포 분류 기술을 사용하여 수행된다. CD11b는 미세아교세포를 포함한 골수성 세포의 표면에서 발현되는 인테그린 수용체이다. 뇌 내에 염증 문제가 없을 때 거의 모든 CD11b+ 세포는 미세아교세포30입니다. 이전에 발표된 다른 방법 23,24,25,26,27,28,29와 비교 하여, 본 프로토콜은 즉각적인 생체외 미세아교세포 활성화 분석과 일반적인 시험관 내 1차 미세아교세포 배양의 균형을 맞춘다. 따라서 미세아교세포는 (1) 미엘린 제거 없이 출생 후 (P)8에 분리되고, (2) 혈청 없이 배양되며, (3) 뇌 분리 후 48시간 만에 siRNA, miRNA, 약리학적 화합물 및/또는 염증 자극에 노출됩니다. 이 세 가지 측면 각각은 현재 프로토콜을 적절하고 빠르게 만듭니다. 우선, 소아 미세아교세포의 사용은 잠재적으로 시험관 내에서 미세아교세포 반응성을 수정할 수 있는 추가적인 탈수초 단계를 요구하지 않고 배양에서 역동적이고 반응성이 있는 생존 세포를 얻을 수 있게 한다. 본 프로토콜은 미세아교세포의 생리적 환경에 가능한 한 근접하는 것을 목표로 한다. 실제로, 미세 아교 세포는 혈청을 만나지 않으며,이 프로토콜은 혈청을 사용할 필요도 없습니다. 또한 배양 후 48 시간 만에 미세 아교 세포를 노출하면 생리 능력을 잃지 않습니다.

Protocol

프로토콜은 승인되었고 모든 동물은 Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, France)의 기관 지침에 따라 처리되었습니다. 6웰, 12웰 또는 96웰 플레이트로 분할된 P8에서 24개의 OF1 마우스 새끼(수컷과 암컷 모두)의 뇌에서 미세아교세포의 자기 분리가 제시됩니다. 실험 작업은 멸균 상태를 유지하기 위해 후드 하에서 수행되었습니다. 1. 분리 및 세포 배양을 위?…

Representative Results

미세아교세포는 환경적 문제(외상, 독성 분자, 염증)4,5,6,34에 노출될 때 활성화되는 CNS 상주 대식세포입니다(그림 3A). 미세아교세포에 대한 시험관 내 연구는 일반적으로 이러한 환경적 문제와 관련된 세포 자율 메커니즘을 평가하고 약리학적 또는 유전적 조작 후 활성화…

Discussion

현재 연구는 자기적으로 분류된 CD11b+ 세포를 사용하는 1차 소교세포 배양을 제시합니다. 소교세포 기능 평가(RT-qPCR 및 식세포 분석) 외에도 미세아교세포 배양 순도도 측정되었습니다.

고전적인 미세아교세포 세포 배양은 일반적으로 P1 또는 P2 설치류 신생아 뇌에서 생성되고 최소 10일 동안 성상교세포와 공동 배양됩니다. 그런 다음 미세아교세포를 오비탈 셰이커를 사용하?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

피규어는 바이오렌더를 사용하여 생성되었습니다. 연구는 Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation de France, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, Investissement d’ Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS 및 Investissement d’ Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.의 추가 보조금을 지원합니다.

Materials

Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388
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References

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

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Keywords: MicrogliaMagnetic Cell SortingNeonate MousePrimary Cell CultureCD11bCell DissociationHBSSSorting BufferCell SeparationCell Count
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Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).
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