JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
신경과학

Magnetisk isolasjon av mikroglialceller fra nyfødt mus for primære cellekulturer

Published: July 25, 2022
doi:
10.3791/62964
, , , , , , , , , ,
1NeuroDiderot, Inserm UMR-1141, Hôpital Robert Debré 48,Université de Paris, 2Department of anesthesia and critical care,APHP-Sorbonne university

Summary

Primære mikrogliakulturer brukes ofte til å evaluere nye antiinflammatoriske molekyler. Denne protokollen beskriver en reproduserbar og relevant metode for magnetisk å isolere mikroglia fra nyfødte valper.

Abstract

Microglia, som hjernen bosatt makrofager, er grunnleggende for flere funksjoner, inkludert respons på miljøstress og hjernen homeostase. Microglia kan ta i bruk et stort spekter av aktiveringsfenotyper. Videre er mikroglia som støtter proinflammatorisk fenotype forbundet med både nevrodevelopmentale og nevrodegenerative lidelser. In vitro-studier er mye brukt i forskning for å evaluere potensielle terapeutiske strategier i bestemte celletyper. I denne sammenheng er det mer relevant å studere mikrogliaaktivering og nevroinflammasjon in vitro ved bruk av primære mikrogliakulturer enn mikroglialcellelinjer eller stamcelleavledet mikroglia. Imidlertid kan bruken av noen primære kulturer lide av mangel på reproduserbarhet. Denne protokollen foreslår en reproduserbar og relevant metode for magnetisk isolering av mikroglia fra nyfødte valper. Mikroglial aktivering ved bruk av flere stimuli etter 4 timer og 24 timer ved mRNA-ekspresjonskvantifisering og en Cy3-perlefagocytisk analyse er demonstrert her. Det nåværende arbeidet forventes å gi en lett reproduserbar teknikk for å isolere fysiologisk relevant mikroglia fra juvenile utviklingsstadier.

Introduction

Microglia er makrofaglignende celler i sentralnervesystemet avledet fra erytropoetiske forløpere til plommesekken som migrerer til nevroepitelet under tidlig embryonal utvikling1. Bortsett fra deres immunitetsfunksjoner, spiller de også en betydelig rolle under nevroutvikling, spesielt for synaptogenese, nevronhomeostase ogmyelinisering. I voksen alder utvikler mikroglia lange cellulære prosesser for å skanne miljøet kontinuerlig. Ved homeostasebrudd som hjerneskade eller hjernesykdom, kan mikroglia endre sitt morfologiske utseende for å vedta en amoeboid form, migrere til det skadede området, øke og frigjøre mange cytoprotektive eller cytotoksiske faktorer. Microglia har heterogene aktiveringstilstander avhengig av utviklingsstadiet og typen skade som ble påført 3,4,5. I denne studien er disse aktiveringstilstandene bredt klassifisert i tre forskjellige fenotyper: pro-inflammatorisk / fagocytisk, antiinflammatorisk og immunregulatorisk, med tanke på at situasjonen i virkeligheten sannsynligvis vil være mer kompleks6.

Studier in vivo mikroglial aktivering og screening for nevrobeskyttende strategier i tidlige stadier av hjernens utvikling kan være utfordrende på grunn av (1) skjørheten til dyr før avvenning og (2) det lave antallet mikrogliaceller. Derfor er in vitro-studier på mikroglia mye brukt for toksisitet 7,8,9, nevrobeskyttende strategier5,10,11,12,13,14 og kokulturer 15,16,17,18,19,20,21 . In vitro-studier kan bruke enten mikrogliacellelinjer, stamcelleavledet mikroglia eller primær mikrogliakultur. Alle disse tilnærmingene har fordeler og ulemper, og valget avhenger av det første biologiske spørsmålet. Fordelene ved å bruke primære mikrogliakulturer er den homogene genetiske bakgrunnen, patogenfri historie og kontroll av tiden da mikroglia stimuleres etter dyredød22.

Gjennom årene ble forskjellige metoder (flowcytometri, risting eller magnetisk merking) utviklet for dyrking av primær mikroglia fra gnagere, både nyfødte og voksne 23,24,25,26,27,28,29. I det foreliggende arbeidet utføres mikroglia-isolering fra musenyfødte valper ved bruk av tidligere beskrevet magnetisk aktivert cellesorteringsteknologi ved bruk av mikroperlebelagt anti-mus CD11b25,27,29. CD11b er en integrinreseptor uttrykt på overflaten av myeloide celler, inkludert mikroglia. Når det ikke er noen inflammatorisk utfordring i hjernen, er nesten alle CD11b+-celler microglia30. Sammenlignet med andre tidligere publiserte metoder 23,24,25,26,27,28,29, balanserer den nåværende protokollen umiddelbare ex vivo mikrogliale aktiveringsanalyser og vanlig in vitro primær mikroglialkultur. Dermed blir mikroglia (1) isolert på postnatal dag (P)8 uten fjerning av myelin, (2) dyrket uten serum, og (3) eksponert enten for siRNA, miRNA, farmakologisk forbindelse og/eller inflammatoriske stimuli bare 48 timer etter hjerneisolering. Hvert av disse tre aspektene gjør den nåværende protokollen relevant og rask. Først og fremst tillater bruk av pediatrisk mikroglia å oppnå dynamiske og reaktive levedyktige celler i kultur uten å kreve et ekstra demyeliniseringstrinn som potensielt kan modifisere mikroglial reaktivitet in vitro. Den nåværende protokollen tar sikte på å komme så nært som mulig til det fysiologiske miljøet til microglia. Faktisk møter microglia aldri serum, og denne protokollen krever heller ikke bruk av serum. Videre forhindrer eksponering av mikroglia så tidlig som 48 timer etter kultur at de mister sine fysiologiske fakulteter.

Protocol

Protokollen ble godkjent, og alle dyrene ble håndtert i henhold til de institusjonelle retningslinjene til Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Frankrike). Magnetisk isolasjon av mikroglia fra hjernen til 24 OF1 musevalper (både mannlige og kvinnelige) ved P8, delt inn i 6-brønns, 12-brønns eller 96-brønnplater, presenteres. Det eksperimentelle arbeidet ble utført under en hette for å opprettholde sterile forhold. 1. Fremstilling av sterile løsn…

Representative Results

Microglia er den CNS-bosatte makrofagen som aktiveres når den utsettes for miljøutfordringer (traumer, giftige molekyler, betennelse) 4,5,6,34 (figur 3A). In vitro-studier på mikroglia brukes ofte til å evaluere celleautonome mekanismer relatert til disse miljøutfordringene og karakterisere aktiveringstilstanden etter farmakologisk eller genetisk mani…

Discussion

Det nåværende arbeidet presenterer en primær mikroglial cellekultur ved hjelp av magnetisk sorterte CD11b + celler. I tillegg til mikroglial funksjonsevaluering (RT-qPCR og fagocytiske analyser) ble også mikrogliakulturrenhet bestemt.

Klassiske microglia cellekulturer er vanligvis generert fra P1 eller P2 gnager nyfødte hjernen og co-kultur med astrocytter i minst 10 dager. Microglia separeres deretter mekanisk ved hjelp av en orbital shaker. Metoden for å isolere og dyrke mikroglia …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Figurer ble opprettet ved hjelp av BioRender. Forskning er finansiert av Inserm, Université de Paris, Horizon 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco, og et tilleggsstipend fra Investissement d’Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS og Investissement d’Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Materials

Anti mouse ACSA-2 PE Vio 615 Miltenyi Biotec 130-116-246
Anti mouse CD11b BV421 Sony Biotechnology 1106255
Anti mouse CD45 BV510 Sony Biotechnology 1115690
Anti mouse CX3CR1 PE Cy7 Sony Biotechnology 1345075
Anti mouse NeuN PE Milli-Mark FCMAB317PE
anti mouse O4 Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-120-016
BD Cytofix/Cytoperm permeabilization kit BD Biosciences 554655
Bovine Serum Albumin Miltenyi Biotec 130-091-376
CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m Miltenyi Biotec 130-093-634
Confocal microscope Leica TCS SP8
D-PBS (10x) Thermo Scientific 14200067
EDTA Sigma-Aldrich E1644
Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353043
Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid Dutscher 353072
Falcon tubes 50 mL Dutscher 352098
Fc blocking reagent (Mouse CD16/32) BD Biosciences 553142
Fluorescence microscope Nikon ECLIPSE TE300
gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) Miltenyi Biotec 130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with Heaters Miltenyi Biotec 130-096-427
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x Thermo Scientific 14065049
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x Thermo Scientific 14185045
iQ SYBR Green Supermix Bio-rad 1725006CUST
Iscript c-DNA synthesis Bio-rad 1708890
Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent red Sigma-Aldrich L2776-1mL
Lipopolysaccharides (LPS) from Escherichia coli O55:B5 Sigma-Aldrich L2880
Macrophage-SFM serum-free medium Thermo Scientific 12065074
MACS BSA Stock Solution Miltenyi Biotec 130-091-376
MACS SmartStrainers (70 μm), 4 x 25 pcs Miltenyi Biotec 130-110-916
Mouse IgG1 PE Millipore MABC002H
Mouse IgG2a PE Cy7 Sony Biotechnology 2601265
Mouse IL1 beta Miltenyi Biotec 130-101-684
Multi-24 Column Blocks Miltenyi Biotec 130-095-691
MultiMACS Cell24 Separator Miltenyi Biotec
Neural Tissue Dissociation Kit – Papain Miltenyi Biotec 130-092-628
Nucleocounter NC-200 Chemometec
Nucleospin RNA Plus XS Macherey Nagel 740990.5
Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes Thermo Scientific 362694
OPTILUX Petri dish – 100 x 20 mm Dutscher 353003
Pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL) Thermo Scientific 15140122
Rat IgG2b, k BV421 BD Biosciences 562603
Rat IgG2b, k BV510 Sony Biotechnology 2603230
REA control (S) PE vio 615 Miltenyi Biotec 130-104-616
REA control (S) Vio Bright B515 Miltenyi Biotec 130-113-445
Recombinant Mouse IFN-gamma Protein R&D System 485-MI
Recombinant Mouse IL-10 Protein R&D System 417-ML
Recombinant Mouse IL-4 Protein R&D System 404-ML
RIPA Buffer Sigma-Aldrich R0278
Viability probe (FVS780) BD Biosciences 565388
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
  2. Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain function. Trends in Molecular Medicine. 25 (11), 967-979 (2019).
  3. Hellstrom Erkenstam, N., et al. Temporal characterization of microglia/macrophage phenotypes in a mouse model of neonatal hypoxic-ischemic brain injury. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 286 (2016).
  4. Chhor, V., et al. Role of microglia in a mouse model of paediatric traumatic brain injury. Brain, Behavior, and Immunity. 63, 197-209 (2017).
  5. Van Steenwinckel, J., et al. Decreased microglial Wnt/beta-catenin signalling drives microglial pro-inflammatory activation in the developing brain. Brain. 142 (12), 3806-3833 (2019).
  6. Chhor, V., et al. Characterization of phenotype markers and neuronotoxic potential of polarised primary microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 32, 70-85 (2013).
  7. Di Pietro, P., et al. Bisphenol A induces DNA damage in cells exerting immune surveillance functions at peripheral and central level. Chemosphere. 254, 126819 (2020).
  8. Roque, P. J., Dao, K., Costa, L. G. Microglia mediate diesel exhaust particle-induced cerebellar neuronal toxicity through neuroinflammatory mechanisms. Neurotoxicology. 56, 204-214 (2016).
  9. Yun, H. S., Oh, J., Lim, J. S., Kim, H. J., Kim, J. S. Anti-inflammatory effect of wasp venom in BV-2 microglial cells in comparison with bee venom. Insects. 12 (4), 297 (2021).
  10. Nair, S., et al. Lipopolysaccharide-induced alteration of mitochondrial morphology induces a metabolic shift in microglia modulating the inflammatory response in vitro and in vivo. Glia. 67 (6), 1047-1061 (2019).
  11. Fleiss, B., et al. The anti-inflammatory effects of the small molecule pifithrin-micro on BV2 microglia. Developmental Neuroscience. 37 (4-5), 363-375 (2015).
  12. Dean, J. M., et al. Microglial MyD88 signaling regulates acute neuronal toxicity of LPS-stimulated microglia in vitro. Brain, Behavior, and Immunity. 24 (5), 776-783 (2010).
  13. Tang, Y., Wolk, B., Nolan, R., Scott, C. E., Kendall, D. A. Characterization of subtype selective cannabinoid CB2 receptor agonists as potential anti-inflammatory agents. Pharmaceuticals (Basel). 14 (4), 378 (2021).
  14. Liu, C. P., et al. miR146a reduces depressive behavior by inhibiting microglial activation. Molecular Medicine Reports. 23 (6), 463 (2021).
  15. Aquino, G. V., Dabi, A., Odom, G. J., Zhang, F., Bruce, E. D. Evaluating the endothelial-microglial interaction and comprehensive inflammatory marker profiles under acute exposure to ultrafine diesel exhaust particles in vitro. Toxicology. 454, 152748 (2021).
  16. You, J. E., Jung, S. H., Kim, P. H. The effect of Annexin A1 as a potential new therapeutic target on neuronal damage by activated microglia. Molecules and Cells. 44 (4), 195-206 (2021).
  17. Xie, Z., et al. By regulating the NLRP3 inflammasome can reduce the release of inflammatory factors in the co-culture model of tuberculosis H37Ra strain and rat microglia. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 637769 (2021).
  18. Ogunrinade, F. A., et al. Zanthoxylum zanthoxyloides inhibits lipopolysaccharide- and synthetic hemozoin-induced neuroinflammation in BV-2 microglia: roles of NF-kappaB transcription factor and NLRP3 inflammasome activation. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 73 (1), 118-134 (2021).
  19. Fernandez-Arjona, M. D. M., Leon-Rodriguez, A., Lopez-Avalos, M. D., Grondona, J. M. Microglia activated by microbial neuraminidase contributes to ependymal cell death. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 15 (2021).
  20. Du, S., et al. Primary microglia isolation from postnatal mouse brains. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62237 (2021).
  21. Boccazzi, M., et al. The immune-inflammatory response of oligodendrocytes in a murine model of preterm white matter injury: the role of TLR3 activation. Cell Death & Disease. 12 (2), 166 (2021).
  22. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 242 (2018).
  23. Nikodemova, M., Watters, J. J. Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain. Journal of Neuroinflammation. 9, 147 (2012).
  24. Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
  25. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and culture of microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), 70 (2019).
  26. Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
  27. Harms, A. S., Tansey, M. G. Isolation of murine postnatal brain microglia for phenotypic characterization using magnetic cell separation technology. Methods in Molecular Biology. 1041, 33-39 (2013).
  28. Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
  29. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 22 (2020).
  30. Krishnan, M. L., et al. Integrative genomics of microglia implicates DLG4 (PSD95) in the white matter development of preterm infants. Nature Communications. 8 (1), 428 (2017).
  31. Bokobza, C., et al. miR-146b protects the perinatal brain against microglia-induced hypomyelination. Annals of Neurology. 91 (1), 48-65 (2021).
  32. Villapol, S., et al. Early sex differences in the immune-inflammatory responses to neonatal ischemic stroke. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3809 (2019).
  33. Rosiewicz, K. S., et al. Comparison of RNA isolation procedures for analysis of adult murine brain and spinal cord astrocytes. Journal of Neuroscience Methods. 333, 108545 (2020).
  34. Fleiss, B., et al. Microglia-mediated neurodegeneration in perinatal brain injuries. Biomolecules. 11 (1), 99 (2021).
  35. Pawelec, P., Ziemka-Nalecz, M., Sypecka, J., Zalewska, T. The Impact of the CX3CL1/CX3CR1 axis in neurological disorders. Cells. 9 (10), 2277 (2020).
  36. Reynolds, R., Cenci di Bello, I., Dawson, M., Levine, J. The response of adult oligodendrocyte progenitors to demyelination in EAE. Progress in Brain Research. 132, 165-174 (2001).
  37. Duan, W., et al. Novel insights into NeuN: From neuronal marker to splicing regulator. Molecular Neurobiology. 53 (3), 1637-1647 (2016).
  38. Kantzer, C. G., et al. Anti-ACSA-2 defines a novel monoclonal antibody for prospective isolation of living neonatal and adult astrocytes. Glia. 65 (6), 990-1004 (2017).
  39. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean Journal of Anesthesiology. 71 (5), 353-360 (2018).
  40. Chao, C. C., Hu, S., Molitor, T. W., Shaskan, E. G., Peterson, P. K. Activated microglia mediate neuronal cell injury via a nitric oxide mechanism. Journal of Immunology. 149 (8), 2736-2741 (1992).
  41. Boje, K. M., Arora, P. K. Microglial-produced nitric oxide and reactive nitrogen oxides mediate neuronal cell death. Brain Research. 587 (2), 250-256 (1992).
  42. Biber, K., Owens, T., Boddeke, E. What is microglia neurotoxicity (Not). Glia. 62 (6), 841-854 (2014).
  43. Biber, K., Neumann, H., Inoue, K., Boddeke, H. W. Neuronal ‘On’ and ‘Off’ signals control microglia. Trends in Neurosciences. 30 (11), 596-602 (2007).
  44. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  45. Boucsein, C., Kettenmann, H., Nolte, C. Electrophysiological properties of microglial cells in normal and pathologic rat brain slices. European Journal of Neuroscience. 12 (6), 2049-2058 (2000).
  46. Beutner, C., et al. Unique transcriptome signature of mouse microglia. Glia. 61 (9), 1429-1442 (2013).
  47. Schmid, C. D., et al. Differential gene expression in LPS/IFNgamma activated microglia and macrophages: in vitro versus in vivo. Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).
  48. Srivastava, P. K., et al. A systems-level framework for drug discovery identifies Csf1R as an anti-epileptic drug target. Nature Communications. 9 (1), 3561 (2018).

Tags

MicrogliaMagnetic Cell SortingNeonate MousePrimary Cell CultureCD11bCell DissociationHBSSSorting BufferCell SeparationCell Count
check_url/kr/62964?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bokobza, C., Jacquens, A., Zinni, M., Faivre, V., Hua, J., Guenoun, D., Userovici, C., Mani, S., Degos, V., Gressens, P., Van Steenwinckel, J. Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (185), e62964, doi:10.3791/62964 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image