Summary

Multiphoton intravital billeddannelse til overvågning af leukocytrekruttering under arterogenese i en murin bagbensmodel

Published: September 30, 2021
doi:

Summary

Rekruttering af leukocytter og blodplader udgør en væsentlig komponent, der er nødvendig for effektiv vækst af sikkerhedsarterier under arteriogenese. Multifotonmikroskopi er et effektivt værktøj til sporing af celledynamik med høj rumlig-tidsmæssig opløsning in vivo og mindre fototoksicitet til undersøgelse af leukocytrekruttering og ekstravasation under arteriogenese.

Abstract

Arteriogenese afhænger stærkt af leukocyt og blodpladerekruttering til det perivaskulære rum af voksende sikkerhedsfartøjer. Standardmetoden til analyse af sikkerhedsarterier og leukocytter i arteriogenese er ex vivo (immuno-) histologisk metode. Denne teknik tillader imidlertid ikke måling af dynamiske processer såsom blodgennemstrømning, forskydningsspænding, celle-celle-interaktioner og partikelhastighed. Dette papir præsenterer en protokol til overvågning af in vivo-processer i voksende sikkerhedsarterier under arteriogenese ved hjælp af intravital billeddannelse. Metoden beskrevet her er et pålideligt værktøj til dynamikmåling og tilbyder en højkontrastanalyse med minimal fotocytotoksicitet, tilvejebragt ved multifoton excitationsmikroskopi. Før analyse af voksende sikkerhedsarterier blev arteriogenese induceret i adduktormusklen hos mus ved ensidig ligering af lårbensarterien.

Efter ligeringen begyndte de allerede eksisterende sikkerhedsarterier at vokse på grund af øget forskydningsstress. Fireogtyve timer efter operationen blev huden og subkutant fedt over sikkerhedsarterierne fjernet, hvilket konstruerede en lomme til yderligere analyser. For at visualisere blodgennemstrømning og immunceller under in vivo-billeddannelse blev CD41-fluoresceinisothiocyanat (FITC) (blodplader) og CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytter) antistoffer injiceret intravenøst (i.v.) via et kateter placeret i halevenen på en mus. Denne artikel introducerer intravital multifotonbilleddannelse som et alternativ eller in vivo-komplementation til de almindeligt anvendte statiske ex vivo (immuno-) histologiske analyser til undersøgelse af processer, der er relevante for arteriogenese. Sammenfattende beskriver dette papir en ny og dynamisk in vivo-metode til at undersøge immuncellehandel, blodgennemstrømning og forskydningsstress i en bagbensmodel af arteriogenese, hvilket især forbedrer evalueringsmulighederne.

Introduction

På trods af intensiv forskningsinteresse i de senere år er hjerte-kar-sygdomme, fx iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde, stadig den førende globale dødsårsag1. Nuværende behandlinger for disse sygdomme er meget invasive terapier såsom perkutan transluminal angioplastik, perkutan transluminal koronar angioplastik eller bypassoperation2. Derfor er der et presserende behov for udvikling af alternative, ikke-invasive terapeutiske muligheder. Kroppen kan skabe naturlige bypass omkring et stenoseret eller okkluderet kar for at omdirigere den afbrudte blodgennemstrømning til den distale del af stenosen. Denne proces kaldes arteriogenese2. Mange nylige undersøgelser har vist, at øget væskeforskydning påvirker leukocytrekruttering, som spiller en vigtig rolle under arteriogenese3. De vigtigste nuværende muligheder for at analysere rekrutteringen af leukocytter under arteriogenese er ex vivo (immuno-) histologiske analyser eller fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) metode4. For at muliggøre vurdering af leukocytdynamik under arteriogenese præsenterer dette papir en intravital billeddannelsesprotokol med multifotonmikroskopi.

Leukocytter er de vigtigste blodlegemer, der rekrutteres under processen med arteriogenese3. Denne protokol bruger multifotonbilleddannelse til at vise gennemsøgning af klæbende leukocytter mærket med injicerede anti-CD45-PE-antistoffer i sikkerhedsarterier, 24 timer efter induktion af arteriogenese ved lårbensarterieligering (FAL) ved anvendelse af en murin bagbensiskæmi model 5,6. Alternativt kan immunceller mærkes ex vivo og omhyggeligt injiceres i mus, som vist i undersøgelser af angiogenese ved hjælp af intravital mikroskopi7. Blodgennemstrømningen inde i kar og arterier kan visualiseres af CD41-FITC (til mærkning af blodplader), dextran-FITC (plasma) eller af den anden harmoniske generation (SHG), som visualiserer kollagen type 1 til stede i kældermembranen i en del af vaskulærtræet. SHG er en unik gratis mærkningseffekt af multifotonexcitationen. Multifotonbilleddannelse tillader langsigtet cellesporing uden at skade vævet og aktivere cellerne ved laserkraftexcitation. Multifotonmikroskopi er den valgte billeddannelsesmetode til visualisering af fluorescerende mærkede celler og strukturer i levende dyr på grund af dets evne til at excitere fluoroforerne dybere ind i vævet / organerne med minimal fototoksicitet8.

Brugen af tunede infrarøde lasere med impulser leveret inden for femtosekundintervaller ophidser kun fluorokromen på brændplanet uden excitation over og under brændplanet8. Således tillader multifotonmikroskopi høj rumlig-tidsmæssig opløsning, mindre fotoskader og øget vævspenetrationsbilleddannelse til undersøgelse af dynamiske biologiske begivenheder inde i organerne. Det er et ideelt mikroskopiværktøj til billeddannelse af levende dyr. Imidlertid er multifoton og enhver anden kunst af intravital mikroskopi begrænset af vævsbevægelse på grund af hjerteslag, åndedræt, peristaltiske bevægelser, muskeltonalitet og andre fysiologiske funktioner, hvilket forstyrrer billeddannelse erhvervelse og analyse. Da disse bevægelser forringer den tidsmæssige og rumlige opløsning og undertiden endda forbyder efterfølgende analyse, skal de behandles hensigtsmæssigt for at muliggøre nøjagtig dataanalyse og fortolkning. Flere strategier er blevet udviklet til at sænke eller forhindre artefakter fra vævsbevægelse. Denne protokol anvender en in situ drift korrektion software kaldet VivoFollow9 til at korrigere vævsdrift under billedoptagelse. Denne fremgangsmåde giver den nødvendige billedstabilisering, hvilket muliggør langsigtet billeddannelse og cellesporingsanalyse.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af den bayerske dyrepleje- og brugskomité (godkendt af etisk kode: ROB-55.2Vet-2532.Vet_02-17-99); Disse forsøg blev udført i nøje overensstemmelse med de tyske retningslinjer for dyrelovgivningen. 1. Dyr og lårbensarterieligering (FAL) BEMÆRK: For at fremkalde steril inflammation og arteriogenese blev 8-10 uger gamle C57BL/6J-hanmus anvendt. Ingen af musene døde eller led af sårinfektion eller sårhelingsforstyrrelser under e…

Representative Results

Multifotonmikroskopi tilbyder en høj rumlig-tidsmæssig opløsning til leukocytsporing, hvor cellemigrationstrin og hastighed kan spores og overvåges (figur 4A, B). Imidlertid udgør prøvens fysiologiske bevægelse en udfordring, især for langsigtede intravitale mikroskopi-billedoptagelser. Derfor kræves et godt vævspræparat og holdere til at fiksere væv og værktøjer, såsom billeddannelseskorrektion i realtid for vævsdrift, for vellykket og stabil billeddannelses…

Discussion

Den beskrevne metode til multifoton in vivo-analyse af leukocytrekruttering repræsenterer et supplement til almindeligt anvendte værktøjer til leukocytrekrutteringsundersøgelser såsom (immun-) histologiske eller FACS-analyser. Med denne billeddannelsesmetode er det muligt at visualisere mere detaljeret de dynamiske processer i leukocytadhærens og ekstravasation under arteriogenese10. På trods af merværdien af denne metode indeholder den tilbudte protokol nogle kritiske trin og beg…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Undersøgelsen blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, projekt Z01). Vi takker Dr. Susanne Stutte for at have læst manuskriptet.

Materials

1.0 mL Syringe BD Biosciences, San Jose, CA, USA 309628 syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0 3M, St. Paul, MN, USA 1538-0 fixation tape
Atipamezole Zoetis, Berlin, Germany antagonize anesthesia
Buprenorphine Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK antagonize anesthesia
C57/B6J mouse Charles River, Sulzfeld, Germany used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab Biolegend 133904 Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab Biolegend 368510 Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland AK64.2 Disinfection
Eye cream (Bepanthen) Bayer Vital GmbH 5g
Fentanyl CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany anesthesia
Flumazenile Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing Smiths medical Lot 278316 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible BRAUM 1050052 tissue glue
Imaris software Oxford Instruments version 9.2 Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED Leica, Solms, Germany light for microscope
Leica M60 Leica, Solms, Germany microscope for surgery
LEICA MC120 HD Leica, Solms, Germany camera for microscope
Medetomidine Pfizer Pharma, Berlin, Germany anesthesia
Midazolam Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany anesthesia
Multiphoton microscope Lavision TRIMScope II WL 820 nm
NaCl 0.9% Braun, Melsungen, Deutschland 3570310 saline for pocket
Naloxone Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland antagonize anesthesia
Needle 30 G BD Biosciences, San Jose, CA, USA 305128 needle for i.v. catheter
Silk braided suture (0/7) Pearsalls Ltd., Taunton, UK SUT-S 103 suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel SONOSID-ASID BONZ 250 mL 782012 gel for imaging
Vicryl 6.0 suture Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA NW-2347 suture to build pocket
VivoFollow drift correction software Developed by Mykhailo Vladymyrov Reference 9

References

  1. The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020)
  2. Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
  3. Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
  4. Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
  5. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
  6. Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
  7. Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
  8. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques–FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
  9. Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
  10. Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
check_url/kr/62969?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Lasch, M., Vladymyrov, M., van den Heuvel, D., Götz, P., Deindl, E., Ishikawa-Ankerhold, H. Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model. J. Vis. Exp. (175), e62969, doi:10.3791/62969 (2021).

View Video