Rekruttering af leukocytter og blodplader udgør en væsentlig komponent, der er nødvendig for effektiv vækst af sikkerhedsarterier under arteriogenese. Multifotonmikroskopi er et effektivt værktøj til sporing af celledynamik med høj rumlig-tidsmæssig opløsning in vivo og mindre fototoksicitet til undersøgelse af leukocytrekruttering og ekstravasation under arteriogenese.
Arteriogenese afhænger stærkt af leukocyt og blodpladerekruttering til det perivaskulære rum af voksende sikkerhedsfartøjer. Standardmetoden til analyse af sikkerhedsarterier og leukocytter i arteriogenese er ex vivo (immuno-) histologisk metode. Denne teknik tillader imidlertid ikke måling af dynamiske processer såsom blodgennemstrømning, forskydningsspænding, celle-celle-interaktioner og partikelhastighed. Dette papir præsenterer en protokol til overvågning af in vivo-processer i voksende sikkerhedsarterier under arteriogenese ved hjælp af intravital billeddannelse. Metoden beskrevet her er et pålideligt værktøj til dynamikmåling og tilbyder en højkontrastanalyse med minimal fotocytotoksicitet, tilvejebragt ved multifoton excitationsmikroskopi. Før analyse af voksende sikkerhedsarterier blev arteriogenese induceret i adduktormusklen hos mus ved ensidig ligering af lårbensarterien.
Efter ligeringen begyndte de allerede eksisterende sikkerhedsarterier at vokse på grund af øget forskydningsstress. Fireogtyve timer efter operationen blev huden og subkutant fedt over sikkerhedsarterierne fjernet, hvilket konstruerede en lomme til yderligere analyser. For at visualisere blodgennemstrømning og immunceller under in vivo-billeddannelse blev CD41-fluoresceinisothiocyanat (FITC) (blodplader) og CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytter) antistoffer injiceret intravenøst (i.v.) via et kateter placeret i halevenen på en mus. Denne artikel introducerer intravital multifotonbilleddannelse som et alternativ eller in vivo-komplementation til de almindeligt anvendte statiske ex vivo (immuno-) histologiske analyser til undersøgelse af processer, der er relevante for arteriogenese. Sammenfattende beskriver dette papir en ny og dynamisk in vivo-metode til at undersøge immuncellehandel, blodgennemstrømning og forskydningsstress i en bagbensmodel af arteriogenese, hvilket især forbedrer evalueringsmulighederne.
På trods af intensiv forskningsinteresse i de senere år er hjerte-kar-sygdomme, fx iskæmisk hjertesygdom og slagtilfælde, stadig den førende globale dødsårsag1. Nuværende behandlinger for disse sygdomme er meget invasive terapier såsom perkutan transluminal angioplastik, perkutan transluminal koronar angioplastik eller bypassoperation2. Derfor er der et presserende behov for udvikling af alternative, ikke-invasive terapeutiske muligheder. Kroppen kan skabe naturlige bypass omkring et stenoseret eller okkluderet kar for at omdirigere den afbrudte blodgennemstrømning til den distale del af stenosen. Denne proces kaldes arteriogenese2. Mange nylige undersøgelser har vist, at øget væskeforskydning påvirker leukocytrekruttering, som spiller en vigtig rolle under arteriogenese3. De vigtigste nuværende muligheder for at analysere rekrutteringen af leukocytter under arteriogenese er ex vivo (immuno-) histologiske analyser eller fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) metode4. For at muliggøre vurdering af leukocytdynamik under arteriogenese præsenterer dette papir en intravital billeddannelsesprotokol med multifotonmikroskopi.
Leukocytter er de vigtigste blodlegemer, der rekrutteres under processen med arteriogenese3. Denne protokol bruger multifotonbilleddannelse til at vise gennemsøgning af klæbende leukocytter mærket med injicerede anti-CD45-PE-antistoffer i sikkerhedsarterier, 24 timer efter induktion af arteriogenese ved lårbensarterieligering (FAL) ved anvendelse af en murin bagbensiskæmi model 5,6. Alternativt kan immunceller mærkes ex vivo og omhyggeligt injiceres i mus, som vist i undersøgelser af angiogenese ved hjælp af intravital mikroskopi7. Blodgennemstrømningen inde i kar og arterier kan visualiseres af CD41-FITC (til mærkning af blodplader), dextran-FITC (plasma) eller af den anden harmoniske generation (SHG), som visualiserer kollagen type 1 til stede i kældermembranen i en del af vaskulærtræet. SHG er en unik gratis mærkningseffekt af multifotonexcitationen. Multifotonbilleddannelse tillader langsigtet cellesporing uden at skade vævet og aktivere cellerne ved laserkraftexcitation. Multifotonmikroskopi er den valgte billeddannelsesmetode til visualisering af fluorescerende mærkede celler og strukturer i levende dyr på grund af dets evne til at excitere fluoroforerne dybere ind i vævet / organerne med minimal fototoksicitet8.
Brugen af tunede infrarøde lasere med impulser leveret inden for femtosekundintervaller ophidser kun fluorokromen på brændplanet uden excitation over og under brændplanet8. Således tillader multifotonmikroskopi høj rumlig-tidsmæssig opløsning, mindre fotoskader og øget vævspenetrationsbilleddannelse til undersøgelse af dynamiske biologiske begivenheder inde i organerne. Det er et ideelt mikroskopiværktøj til billeddannelse af levende dyr. Imidlertid er multifoton og enhver anden kunst af intravital mikroskopi begrænset af vævsbevægelse på grund af hjerteslag, åndedræt, peristaltiske bevægelser, muskeltonalitet og andre fysiologiske funktioner, hvilket forstyrrer billeddannelse erhvervelse og analyse. Da disse bevægelser forringer den tidsmæssige og rumlige opløsning og undertiden endda forbyder efterfølgende analyse, skal de behandles hensigtsmæssigt for at muliggøre nøjagtig dataanalyse og fortolkning. Flere strategier er blevet udviklet til at sænke eller forhindre artefakter fra vævsbevægelse. Denne protokol anvender en in situ drift korrektion software kaldet VivoFollow9 til at korrigere vævsdrift under billedoptagelse. Denne fremgangsmåde giver den nødvendige billedstabilisering, hvilket muliggør langsigtet billeddannelse og cellesporingsanalyse.
Den beskrevne metode til multifoton in vivo-analyse af leukocytrekruttering repræsenterer et supplement til almindeligt anvendte værktøjer til leukocytrekrutteringsundersøgelser såsom (immun-) histologiske eller FACS-analyser. Med denne billeddannelsesmetode er det muligt at visualisere mere detaljeret de dynamiske processer i leukocytadhærens og ekstravasation under arteriogenese10. På trods af merværdien af denne metode indeholder den tilbudte protokol nogle kritiske trin og beg…
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, projekt Z01). Vi takker Dr. Susanne Stutte for at have læst manuskriptet.
1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |