Imagerie intravitale multiphotonique pour la surveillance du recrutement leucocytaire au cours de l’artériogenèse dans un modèle murin de membre postérieur
Summary
Le recrutement des leucocytes et des plaquettes constitue un composant essentiel nécessaire à la croissance efficace des artères collatérales au cours de l’artériogenèse. La microscopie multiphotonique est un outil efficace pour suivre la dynamique cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée in vivo et moins photo-toxicité pour étudier le recrutement et l’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse.
Abstract
L’artériogenèse dépend fortement du recrutement des leucocytes et des plaquettes dans l’espace périvasculaire des vaisseaux collatéraux en croissance. L’approche standard pour l’analyse des artères collatérales et des leucocytes dans l’artériogenèse est la méthodologie histologique ex vivo . Cependant, cette technique ne permet pas de mesurer des processus dynamiques tels que le flux sanguin, la contrainte de cisaillement, les interactions cellule-cellule et la vitesse des particules. Cet article présente un protocole pour surveiller les processus in vivo dans les artères collatérales en croissance au cours de l’artériogenèse en utilisant l’imagerie intravitale. La méthode décrite ici est un outil fiable pour la mesure dynamique et offre une analyse à contraste élevé avec une photocytotoxicité minimale, fournie par microscopie d’excitation multiphotonique. Avant d’analyser les artères collatérales en croissance, l’artériogenèse a été induite dans le muscle adducteur de souris par ligature unilatérale de l’artère fémorale.
Après la ligature, les artères collatérales préexistantes ont commencé à se développer en raison de l’augmentation de la contrainte de cisaillement. Vingt-quatre heures après la chirurgie, la peau et la graisse sous-cutanée au-dessus des artères collatérales ont été enlevées, construisant une poche pour d’autres analyses. Pour visualiser le flux sanguin et les cellules immunitaires pendant l’imagerie in vivo , des anticorps à base d’isothiocyanate de fluorescéine CD41 (FITC) (plaquettes) et de CD45-phycoérythrine (PE) (leucocytes) ont été injectés par voie intraveineuse (i.v.) via un cathéter placé dans la veine de la queue d’une souris. Cet article présente l’imagerie multiphotonique intravitale comme alternative ou complément in vivo aux analyses histologiques statiques ex vivo (immuno-) couramment utilisées pour étudier les processus pertinents pour l’artériogenèse. En résumé, cet article décrit une méthode in vivo nouvelle et dynamique pour étudier le trafic de cellules immunitaires, le flux sanguin et le stress de cisaillement dans un modèle d’artériogenèse des membres postérieurs, ce qui améliore considérablement les possibilités d’évaluation.
Introduction
Malgré l’intérêt intensif de la recherche au cours des dernières années, les maladies cardiovasculaires, par exemple les cardiopathies ischémiques et les accidents vasculaires cérébraux, demeurent la principale cause mondiale de décès1. Les traitements actuels de ces maladies sont des thérapies hautement invasives telles que l’angioplastie transluminale percutanée, l’angioplastie coronaire transluminale percutanée ou le pontagecoronarien 2. Par conséquent, le développement d’options thérapeutiques alternatives et non invasives est nécessaire de toute urgence. Le corps peut créer des pontages naturels autour d’un vaisseau sténosé ou obstrué pour rediriger le flux sanguin interrompu vers la partie distale de la sténose. Ce processus est appelé artériogenèse2. De nombreuses études récentes ont montré que l’augmentation du cisaillement des fluides a un impact sur le recrutement des leucocytes, qui joue un rôle important lors de l’artériogenèse3. Les principales options actuelles pour analyser le recrutement des leucocytes au cours de l’artériogenèse sont les analyses histologiques ex vivo ou la méthodologie de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)4. Pour permettre l’évaluation de la dynamique des leucocytes au cours de l’artériogenèse, cet article présente un protocole d’imagerie intravitale avec microscopie multiphotonique.
Les leucocytes sont les principales cellules sanguines recrutées au cours du processus d’artériogenèse3. Ce protocole utilise l’imagerie multiphotonique pour montrer le rampement des leucocytes adhérents marqués avec des anticorps anti-CD45-PE injectés dans les artères collatérales, 24 h après l’induction de l’artériogenèse par ligature de l’artère fémorale (LAF) utilisant une ischémie des membres postérieurs murins modèle 5,6. Alternativement, les cellules immunitaires peuvent être marquées ex vivo et soigneusement injectées à la souris, comme le montrent les études sur l’angiogenèse utilisant la microscopie intravitale7. Le flux sanguin à l’intérieur des vaisseaux et des artères peut être visualisé par CD41-FITC (pour marquer les plaquettes), dextran-FITC (plasma), ou par la deuxième génération harmonique (SHG), qui visualise le collagène de type 1 présent dans la membrane basale d’une partie de l’arbre vasculaire. SHG est un effet d’étiquetage libre unique de l’excitation multiphotonique. L’imagerie multiphotonique permet un suivi cellulaire à long terme sans endommager le tissu et activer les cellules par excitation de puissance laser. La microscopie multiphotonique est la méthode d’imagerie de choix pour visualiser les cellules et les structures marquées par fluorescence chez les animaux vivants en raison de sa capacité à exciter les fluorophores plus profondément dans les tissus / organes avec une phototoxicité minimale8.
L’utilisation de lasers infrarouges accordés avec des impulsions délivrées à intervalles femtosecondes excite le fluorochrome uniquement au plan focal, sans excitation au-dessus et au-dessous du plan focal8. Ainsi, la microscopie multiphotonique permet une résolution spatio-temporelle élevée, moins de photo-dommages et une imagerie de pénétration tissulaire accrue pour étudier les événements biologiques dynamiques à l’intérieur des organes. C’est un outil de microscopie idéal pour l’imagerie d’animaux vivants. Cependant, le multiphoton et tout autre art de la microscopie intravitale est limité par le mouvement des tissus dû au rythme cardiaque, à la respiration, aux mouvements péristaltiques, à la tonalité musculaire et à d’autres fonctions physiologiques, ce qui perturbe l’acquisition et l’analyse de l’imagerie. Comme ces mouvements nuisent à la résolution temporelle et spatiale et parfois même à l’analyse ultérieure, ils doivent être traités de manière appropriée pour permettre une analyse et une interprétation précises des données. Plusieurs stratégies ont été développées pour réduire ou prévenir les artefacts du mouvement des tissus. Ce protocole applique un logiciel de correction de la dérive in situ appelé VivoFollow9 pour corriger la dérive tissulaire lors de l’acquisition d’images. Cette approche fournit la stabilisation d’image requise, permettant l’imagerie à long terme et l’analyse du suivi cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode décrite d’analyse multiphotonique in vivo du recrutement leucocytaire représente un complément aux outils couramment utilisés pour les études de recrutement leucocytaire telles que les analyses (immuno-) histologiques ou FACS. Avec cette méthode d’imagerie, il est possible de visualiser plus en détail les processus dynamiques d’adhérence et d’extravasation des leucocytes au cours de l’artériogenèse10. Malgré la valeur ajoutée de cette méthode, le protoco…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, projet Z01). Nous remercions la Dre Susanne Stutte d’avoir lu le manuscrit.
Materials
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
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