Summary

म्यूरिन हिंदलिम्ब मॉडल में धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट भर्ती की निगरानी के लिए मल्टीफोटॉन इंट्रावाइटल इमेजिंग

Published: September 30, 2021
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Summary

ल्यूकोसाइट्स और प्लेटलेट्स की भर्ती धमनीजनन के दौरान संपार्श्विक धमनियों के प्रभावी विकास के लिए आवश्यक एक आवश्यक घटक का गठन करती है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी विवो में उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन के साथ सेल गतिशीलता को ट्रैक करने के लिए एक कुशल उपकरण है और धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट भर्ती और एक्स्ट्रावेसन का अध्ययन करने के लिए कम फोटो-टॉक्सिसिटी है।

Abstract

धमनीजनन दृढ़ता से बढ़ते संपार्श्विक वाहिकाओं के पेरिवास्कुलर स्थान पर ल्यूकोसाइट और प्लेटलेट भर्ती पर निर्भर करता है। धमनीजनन में संपार्श्विक धमनियों और ल्यूकोसाइट्स का विश्लेषण करने के लिए मानक दृष्टिकोण एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल पद्धति है। हालांकि, यह तकनीक रक्त प्रवाह, कतरनी तनाव, सेल-सेल इंटरैक्शन और कण वेग जैसी गतिशील प्रक्रियाओं के माप की अनुमति नहीं देती है। यह पेपर इंट्रावाइटल इमेजिंग का उपयोग करके धमनीजनन के दौरान बढ़ती संपार्श्विक धमनियों में विवो प्रक्रियाओं की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यहां वर्णित विधि गतिशीलता माप के लिए एक विश्वसनीय उपकरण है और मल्टीफोटॉन उत्तेजना माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की गई न्यूनतम फोटो-साइटोटॉक्सिसिटी के साथ एक उच्च-कंट्रास्ट विश्लेषण प्रदान करती है। बढ़ती संपार्श्विक धमनियों का विश्लेषण करने से पहले, ऊरु धमनी के एकतरफा बंधाव द्वारा चूहों की जोड़ की मांसपेशियों में धमनीजनन को प्रेरित किया गया था।

बंधाव के बाद, कतरनी तनाव में वृद्धि के कारण पहले से मौजूद संपार्श्विक धमनियां बढ़ने लगीं। सर्जरी के चौबीस घंटे बाद, संपार्श्विक धमनियों के ऊपर की त्वचा और चमड़े के नीचे की वसा को हटा दिया गया, जिससे आगे के विश्लेषण के लिए एक जेब का निर्माण हुआ। विवो इमेजिंग के दौरान रक्त प्रवाह और प्रतिरक्षा कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, सीडी 41-फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) (प्लेटलेट्स) और सीडी 45-फाइकोएरिथ्रिन (पीई) (ल्यूकोसाइट्स) एंटीबॉडी को एक माउस की पूंछ की नस में रखे कैथेटर के माध्यम से अंतःशिरा (यानी) इंजेक्ट किया गया था। यह लेख इंट्रावाइटल मल्टीफोटॉन इमेजिंग को एक विकल्प के रूप में या आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले स्थैतिक एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए विवो पूरक के रूप में पेश करता है ताकि धमनीजनन के लिए प्रासंगिक प्रक्रियाओं का अध्ययन किया जा सके। सारांश में, यह पेपर धमनीजनन के हिंदलिम्ब मॉडल में प्रतिरक्षा कोशिका तस्करी, रक्त प्रवाह और कतरनी तनाव की जांच करने के लिए विवो विधि में एक उपन्यास और गतिशील का वर्णन करता है, जो मूल्यांकन संभावनाओं को विशेष रूप से बढ़ाता है।

Introduction

हाल के वर्षों के दौरान गहन शोध रुचि के बावजूद, कार्डियोवैस्कुलर बीमारियां, जैसे, इस्केमिक हृदय रोग और स्ट्रोक, अभीभी मृत्यु का प्रमुख वैश्विक कारण हैं। इन बीमारियों के लिए वर्तमान उपचार अत्यधिक आक्रामक उपचार हैं जैसे कि पर्क्यूटेनियस ट्रांसल्यूमिनल एंजियोप्लास्टी, पर्क्यूटेनियस ट्रांसल्यूमिनल कोरोनरी एंजियोप्लास्टी, या बाईपास सर्जरी2। इसलिए, वैकल्पिक, गैर-इनवेसिव चिकित्सीय विकल्पों के विकास की तत्काल आवश्यकता है। शरीर स्टेनोसिस के बाहर के हिस्से में बाधित रक्त प्रवाह को पुनर्निर्देशित करने के लिए एक स्टेनोसेड या अवरुद्ध वाहिका के चारों ओर प्राकृतिक बाईपास बना सकता है। इस प्रक्रिया को धमनीजनन2 कहा जाता है। कई हालिया अध्ययनों से पता चला है कि द्रव कतरनी में वृद्धि ल्यूकोसाइट भर्ती को प्रभावित करती है, जो धमनीजनन3 के दौरान एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट्स की भर्ती का विश्लेषण करने के लिए मुख्य वर्तमान विकल्प एक्स विवो (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण या फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) पद्धति4 हैं। धमनीजनन के दौरान ल्यूकोसाइट गतिशीलता के मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए, यह पेपर मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी के साथ एक इंट्रावाइटल इमेजिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

ल्यूकोसाइट्स धमनीजनन की प्रक्रिया के दौरान भर्तीकी जाने वाली प्रमुख रक्त कोशिकाएं हैं। यह प्रोटोकॉल मल्टीफोटॉन इमेजिंग का उपयोग करता है ताकि संपार्श्विक धमनियों में इंजेक्टेड एंटी-सीडी 45-पीई एंटीबॉडी के साथ लेबल किए गए अनुयायी ल्यूकोसाइट्स के रेंगने को दिखाया जा सके, फेमोरल धमनी बंधाव (एफएएल) द्वारा धमनीजनन के प्रेरण के 24 घंटे बाद, एक मुराइन हिंदलिम्ब इस्किमिया मॉडल 5,6 का उपयोग करके। वैकल्पिक रूप से, प्रतिरक्षा कोशिकाओं को एक्स विवो लेबल किया जा सकता है और चूहों में सावधानीपूर्वक इंजेक्ट किया जा सकता है, जैसा कि इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी7 का उपयोग करके एंजियोजेनेसिस पर अध्ययन में दिखाया गया है। वाहिकाओं और धमनियों के अंदर रक्त प्रवाह को सीडी 41-एफआईटीसी (प्लेटलेट्स लेबल करने के लिए), डेक्सट्रान-एफआईटीसी (प्लाज्मा), या दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) द्वारा देखा जा सकता है, जो संवहनी पेड़ के कुछ हिस्से के तहखाने झिल्ली में मौजूद कोलेजन टाइप 1 की कल्पना करता है। एसएचजी मल्टीफोटॉन उत्तेजना का एक अनूठा मुक्त लेबलिंग प्रभाव है। मल्टीफोटॉन इमेजिंग ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना और लेजर पावर उत्तेजना द्वारा कोशिकाओं को सक्रिय किए बिना दीर्घकालिक सेल ट्रैकिंग की अनुमति देता है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी जीवित जानवरों में फ्लोरोसेंटली लेबल कोशिकाओं और संरचनाओं को देखने के लिए पसंद की इमेजिंग विधि है क्योंकि यह फ्लोरोफोर को ऊतक / अंगों में गहराई से उत्तेजित करने की क्षमता के कारणहै।

फेम्टोसेकंड अंतराल के भीतर वितरित दालों के साथ ट्यून किए गए इन्फ्रारेड लेजर का उपयोग केवल फोकल प्लेन पर फ्लोरोक्रोम को उत्तेजित करता है, जिसमें फोकल प्लेन8 के ऊपर और नीचे कोई उत्तेजना नहीं होती है। इस प्रकार, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी अंगों के अंदर गतिशील जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन, कम फोटो-क्षति और ऊतक प्रवेश इमेजिंग में वृद्धि की अनुमति देता है। यह लाइव-पशु इमेजिंग के लिए एक आदर्श माइक्रोस्कोपी उपकरण है। हालांकि, मल्टीफोटॉन और इंट्रावाइटल माइक्रोस्कोपी की कोई अन्य कला दिल की धड़कन, श्वसन, पेरिस्टाल्टिक आंदोलनों, मांसपेशियों की टोनैलिटी और अन्य शारीरिक कार्यों के कारण ऊतक गति से सीमित है, जो इमेजिंग अधिग्रहण और विश्लेषण को परेशान करती है। चूंकि ये आंदोलन अस्थायी और स्थानिक संकल्प को खराब करते हैं और कभी-कभी बाद के विश्लेषण को भी प्रतिबंधित करते हैं, इसलिए उन्हें सटीक डेटा विश्लेषण और व्याख्या को सक्षम करने के लिए उचित रूप से संबोधित किया जाना चाहिए। ऊतक गति से कलाकृतियों को कम करने या रोकने के लिए कई रणनीतियों का विकास किया गया है। यह प्रोटोकॉल छवि अधिग्रहण के दौरान ऊतक बहाव को सही करने के लिए VivoFollow9 नामक एक सीटू बहाव सुधार सॉफ्टवेयर लागू करता है। यह दृष्टिकोण आवश्यक छवि स्थिरीकरण प्रदान करता है, जो दीर्घकालिक इमेजिंग और सेल-ट्रैकिंग विश्लेषण को सक्षम करता है।

Protocol

इस अध्ययन को बवेरियन पशु देखभाल और उपयोग समिति (नैतिक कोड द्वारा अनुमोदित: आरओबी-55.2वेट-2532.Vet_02-17-99) द्वारा अनुमोदित किया गया था; ये प्रयोग जर्मन पशु कानून दिशानिर्देशों के अनुसार सख्ती से किए गए थे। <p class="jove_titl…

Representative Results

मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी ल्यूकोसाइट ट्रैकिंग के लिए एक उच्च स्थानिक-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन प्रदान करता है, जिसमें सेल माइग्रेशन चरणों और गति को ट्रैक और मॉनिटर किया जा सकता है (चित्रा 4 ए, …

Discussion

ल्यूकोसाइट भर्ती के विवो विश्लेषण में मल्टीफोटॉन की वर्णित विधि ल्यूकोसाइट भर्ती अध्ययन जैसे (इम्यूनो-) हिस्टोलॉजिकल या एफएसीएस विश्लेषण के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले उपकरणों के अतिरिक्त क?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

अध्ययन को डॉयचे फोर्सचुंगस्जेमिनशाफ्ट एसएफबी 914 (एचआई-ए / एसएम, प्रोजेक्ट जेड 01) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। हम पांडुलिपि पढ़ने के लिए डॉ सुज़ैन स्टट को धन्यवाद देते हैं।

Materials

1.0 mL Syringe BD Biosciences, San Jose, CA, USA 309628 syringe for injection
3M Durapore Surgical Tape 1538-0 3M, St. Paul, MN, USA 1538-0 fixation tape
Atipamezole Zoetis, Berlin, Germany antagonize anesthesia
Buprenorphine Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK antagonize anesthesia
C57/B6J mouse Charles River, Sulzfeld, Germany used animals for surgery/imaging
CD41-FITC ab Biolegend 133904 Platelet labeling in vivo
CD45-PE ab Biolegend 368510 Leukocytes labelling in vivo
Disinfectant Cutasept Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland AK64.2 Disinfection
Eye cream (Bepanthen) Bayer Vital GmbH 5g
Fentanyl CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany anesthesia
Flumazenile Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland antagonize anesthesia
Fine bore polythene tubing Smiths medical Lot 278316 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter
Histoacryl flexible BRAUM 1050052 tissue glue
Imaris software Oxford Instruments version 9.2 Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection
Laser Doppler Imaging instrument Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany
LEICA KL300 LED Leica, Solms, Germany light for microscope
Leica M60 Leica, Solms, Germany microscope for surgery
LEICA MC120 HD Leica, Solms, Germany camera for microscope
Medetomidine Pfizer Pharma, Berlin, Germany anesthesia
Midazolam Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany anesthesia
Multiphoton microscope Lavision TRIMScope II WL 820 nm
NaCl 0.9% Braun, Melsungen, Deutschland 3570310 saline for pocket
Naloxone Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland antagonize anesthesia
Needle 30 G BD Biosciences, San Jose, CA, USA 305128 needle for i.v. catheter
Silk braided suture (0/7) Pearsalls Ltd., Taunton, UK SUT-S 103 suture for femoral artery ligation
Ultrason Gel SONOSID-ASID BONZ 250 mL 782012 gel for imaging
Vicryl 6.0 suture Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA NW-2347 suture to build pocket
VivoFollow drift correction software Developed by Mykhailo Vladymyrov Reference 9

References

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Lasch, M., Vladymyrov, M., van den Heuvel, D., Götz, P., Deindl, E., Ishikawa-Ankerhold, H. Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model. J. Vis. Exp. (175), e62969, doi:10.3791/62969 (2021).

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