マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング
Summary
白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで 高い時空間分解能と光毒性の低い細胞ダイナミクスを追跡するための効率的なツールです。
Abstract
動脈形成は、成長する側副血管の血管周囲腔への白血球および血小板動員に強く依存する。動脈形成における側副動脈および白血球を分析するための標準的なアプローチは、 ex vivo (免疫)組織学的方法論である。ただし、この手法では、血流、せん断応力、細胞間相互作用、粒子速度などの動的プロセスを測定できません。この論文は、生体内イメージングを利用して、動脈形成中に成長する側副動脈の in vivo プロセスを監視するためのプロトコルを提示します。ここで説明する方法は、ダイナミクス測定のための信頼性の高いツールであり、多光子励起顕微鏡によって提供される最小限の光細胞毒性で高コントラスト分析を提供します。成長する側副動脈を分析する前に、大腿動脈の片側結紮によってマウスの内転筋に動脈形成が誘導された。
結紮後、せん断応力の増加により既存の側副動脈が成長し始めました。術後24時間で側副動脈の上の皮膚と皮下脂肪を取り除き、さらなる分析のためのポケットを構築した。in vivoイメージング中の血流および免疫細胞を視覚化するために、CD41-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)(血小板)およびCD45-フィコエリスリン(PE)(白血球)抗体を、マウスの尾静脈に配置されたカテーテルを介して静脈内(i.v.)注射した。この記事では、動脈形成に関連するプロセスを研究するために、一般的に使用される静的ex vivo(免疫)組織学的分析の代替またはin vivo補完として、生体内多光子イメージングを紹介します。要約すると、この論文は、動脈形成の後肢モデルにおける免疫細胞輸送、血流、およびせん断応力を調査するための新規で動的なin vivo法について説明し、評価の可能性を著しく高めます。
Introduction
近年の集中的な研究の関心にもかかわらず、虚血性心疾患や脳卒中などの心血管疾患は、依然として世界の主要な死因です1。これらの疾患に対する現在の治療法は、経皮経管的血管形成術、経皮的経管的冠動脈形成術、バイパス手術などの高侵襲療法です2。したがって、代替の非侵襲的治療選択肢の開発が緊急に必要とされている。身体は、狭窄または閉塞した血管の周りに自然なバイパスを作成して、中断された血流を狭窄の遠位部分に向け直すことができます。このプロセスは動脈形成2と呼ばれます。最近の多くの研究では、流体せん断の増加が動脈形成中に重要な役割を果たす白血球動員に影響を与えることが示されています3。動脈形成中の白血球の動員を分析するための現在の主なオプションは、 ex vivo (免疫)組織学的分析または蛍光活性化セルソーティング(FACS)方法論です4。動脈形成中の白血球動態の評価を可能にするために、この論文は多光子顕微鏡による生体内イメージングプロトコルを提示します。
白血球は、動脈形成の過程で動員される主要な血球です3。このプロトコルは、多光子イメージングを使用して、マウス後肢虚血モデル5,6を採用した大腿動脈結紮(FAL)による動脈形成の誘導から24時間後に、側副動脈に注射された抗CD45-PE抗体で標識された付着性白血球のクロールを示します。あるいは、免疫細胞をex vivoで標識し、生体内顕微鏡を用いた血管新生に関する研究で示されているように、マウスに注意深く注射することができます7。血管および動脈内の血流は、CD41-FITC(血小板を標識するため)、デキストラン-FITC(血漿)、または血管樹の一部の基底膜に存在するコラーゲンタイプ1を視覚化する第2高調波発生(SHG)によって視覚化できます。SHGは、多光子励起のユニークな遊離標識効果です。多光子イメージングは、組織を傷つけたり、レーザーパワー励起によって細胞を活性化したりすることなく、長期的な細胞追跡を可能にします。多光子顕微鏡は、蛍光色素を最小限の光毒性で組織/臓器の奥深くまで励起できるため、生きている動物の蛍光標識された細胞や構造を視覚化するためのイメージング法として最適です8。
フェムト秒間隔内にパルスが供給される同調された赤外線レーザーを使用すると、焦点面8の上下に励起することなく、焦点面でのみ蛍光色素が励起されます。したがって、多光子顕微鏡は、臓器内の動的な生物学的事象を研究するための高い時空間分解能、より少ない光損傷、および組織浸透イメージングの増加を可能にします。生きた動物のイメージングに理想的な顕微鏡ツールです。ただし、多光子やその他の生体内顕微鏡検査の技術は、心拍、呼吸、蠕動運動、筋肉の緊張、およびその他の生理学的機能による組織の動きによって制限され、画像の取得と分析を妨げます。これらの動きは時間的および空間的な分解能を損ない、時にはその後の分析を妨げることさえあるため、正確なデータ分析と解釈を可能にするために適切に対処する必要があります。組織の動きによるアーチファクトを低減または防止するために、いくつかの戦略が開発されています。このプロトコルは、VivoFollow9と呼ばれるin situドリフト補正ソフトウェアを適用して、画像取得中の組織ドリフトを補正します。このアプローチは、必要な画像安定化を提供し、長期的なイメージングと細胞追跡分析を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載された白血球動員の多光子 インビボ 分析の方法は、(免疫−)組織学的またはFACS分析のような白血球動員研究のために一般的に使用されるツールへの追加を表す。このイメージング方法を用いると、動脈形成10時の白血球付着および血管外漏出における動的過程をより詳細に可視化することができる。この方法の付加価値にもかかわらず、提供されるプロトコルに…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914(HI-A/SM、プロジェクトZ01)によって資金提供されました。原稿を読んでくださったスザンネ・シュトゥッテ博士に感謝します。
Materials
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020)
- Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
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