Multifoton intravital avbildning for overvåking av leukocyttrekruttering under arteriogenese i en murine baklemmodell
Summary
Rekrutteringen av leukocytter og blodplater utgjør en viktig komponent som er nødvendig for effektiv vekst av sikkerhetsarterier under arteriogenese. Multifotonmikroskopi er et effektivt verktøy for sporing av celledynamikk med høy spatio-temporal oppløsning in vivo og mindre fototoksisitet for å studere leukocyttrekruttering og ekstravasasjon under arteriogenese.
Abstract
Arteriogenese er sterkt avhengig av leukocytt- og blodplaterekruttering til det perivaskulære rommet av voksende sikkerhetsfartøy. Standard tilnærming for analyse av kollaterale arterier og leukocytter i arteriogenese er ex vivo (immun-) histologisk metodikk. Denne teknikken tillater imidlertid ikke måling av dynamiske prosesser som blodstrøm, skjærspenning, celle-celle-interaksjoner og partikkelhastighet. Dette papiret presenterer en protokoll for å overvåke in vivo-prosesser i voksende sikkerhetsarterier under arteriogenese ved bruk av intravital bildebehandling. Metoden beskrevet her er et pålitelig verktøy for dynamisk måling og tilbyr en høykontrastanalyse med minimal fotocytotoksisitet, levert ved multifotoneksitasjonsmikroskopi. Før analyse av voksende kollaterale arterier ble arteriogenese indusert i adduktormuskelen hos mus ved ensidig ligering av lårarterien.
Etter ligeringen begynte de eksisterende sikkerhetsarteriene å vokse på grunn av økt skjærspenning. Tjuefire timer etter operasjonen ble huden og subkutant fett over kollaterale arterier fjernet, og konstruerte en lomme for videre analyser. For å visualisere blodstrøm og immunceller under in vivo-avbildning, ble CD41-fluoresceinisotiocyanat (FITC) (blodplater) og CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytter) antistoffer injisert intravenøst (i.v.) via et kateter plassert i halevenen til en mus. Denne artikkelen introduserer intravital multifotonavbildning som et alternativ eller in vivo komplement til de vanlige statiske ex vivo (immun-) histologiske analysene for å studere prosesser som er relevante for arteriogenese. Oppsummert beskriver dette papiret en ny og dynamisk in vivo-metode for å undersøke immuncellehandel, blodstrøm og skjærspenning i en bakkroppsmodell av arteriogenese, noe som forbedrer evalueringsmulighetene spesielt.
Introduction
Til tross for intensiv forskningsinteresse de siste årene, er kardiovaskulære sykdommer, for eksempel iskemisk hjertesykdom og hjerneslag, fortsatt den ledende globale dødsårsaken1. Nåværende behandlinger for disse sykdommene er svært invasive terapier som perkutan transluminal angioplastikk, perkutan transluminal koronar angioplastikk eller bypassoperasjon2. Derfor er det et presserende behov for utvikling av alternative, ikke-invasive terapeutiske alternativer. Kroppen kan skape naturlige bypass rundt et stenosert eller okkludert kar for å omdirigere den avbrutte blodstrømmen til den distale delen av stenose. Denne prosessen kalles arteriogenese2. Mange nyere studier har vist at økt væskeskjær påvirker leukocyttrekruttering, som spiller en viktig rolle under arteriogenese3. De viktigste nåværende alternativene for å analysere rekrutteringen av leukocytter under arteriogenese er ex vivo (immun-) histologiske analyser eller fluorescensaktivert cellesortering (FACS) metodikk4. For å muliggjøre vurdering av leukocyttdynamikk under arteriogenese, presenterer denne artikkelen en intravital avbildningsprotokoll med multifotonmikroskopi.
Leukocytter er de viktigste blodcellene som rekrutteres under prosessen med arteriogenese3. Denne protokollen bruker multifotonavbildning for å vise gjennomgang av adherente leukocytter merket med injiserte anti-CD45-PE-antistoffer i kollaterale arterier, 24 timer etter induksjon av arteriogenese ved femoral arterieligering (FAL) ved bruk av en murine baklemmeiskemi modell 5,6. Alternativt kan immunceller merkes ex vivo og injiseres forsiktig i mus, som vist i studier på angiogenese ved bruk av intravital mikroskopi7. Blodstrømmen i kar og arterier kan visualiseres av CD41-FITC (for å merke blodplater), dextran-FITC (plasma), eller ved den andre harmoniske generasjonen (SHG), som visualiserer kollagen type 1 tilstede i kjellermembranen til en del av det vaskulære treet. SHG er en unik gratis merkingseffekt av multifotoneksitasjonen. Multifotonavbildning tillater langsiktig cellesporing uten å skade vevet og aktivere cellene ved laserkrafteksitasjon. Multifotonmikroskopi er den valgte avbildningsmetoden for visualisering av fluorescerende merkede celler og strukturer i levende dyr på grunn av sin evne til å opphisse fluoroforene dypere inn i vevet / organene med minimal fototoksisitet8.
Bruken av innstilte infrarøde lasere med pulser levert innen femtosekundintervaller eksiterer fluorokromet bare ved fokalplanet, uten eksitasjon over og under fokalplanet8. Dermed tillater multifotonmikroskopi høy spatio-temporal oppløsning, mindre fotoskade og økt vevpenetrasjonsavbildning for å studere dynamiske biologiske hendelser inne i organene. Det er et ideelt mikroskopiverktøy for levende dyravbildning. Imidlertid er multifoton og annen kunst av intravital mikroskopi begrenset av vevsbevegelse på grunn av hjerteslag, respirasjon, peristaltiske bevegelser, muskeltonalitet og andre fysiologiske funksjoner, noe som forstyrrer bildeoppkjøp og analyse. Siden disse bevegelsene svekker tidsmessig og romlig oppløsning og noen ganger til og med forbyr etterfølgende analyse, må de adresseres på riktig måte for å muliggjøre nøyaktig dataanalyse og tolkning. Flere strategier har blitt utviklet for å senke eller forhindre gjenstander fra vevsbevegelse. Denne protokollen bruker en in situ drift korreksjon programvare kalt VivoFollow9 for å korrigere vev drift under bildeopptak. Denne tilnærmingen gir den nødvendige bildestabiliseringen, noe som muliggjør langsiktig bildebehandling og cellesporingsanalyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne metoden for multifoton in vivo-analyse av leukocyttrekruttering representerer et tillegg til vanlige verktøy for leukocyttrekrutteringsstudier som (immun-) histologiske eller FACS-analyser. Med denne avbildningsmetoden er det mulig å visualisere i større detalj de dynamiske prosessene i leukocyttadherens og ekstravasasjon under arteriogenese10. Til tross for merverdien av denne metoden, inneholder den tilbudte protokollen noen kritiske trinn og begrensninger. Se t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studien ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A/SM, prosjekt Z01). Vi takker Dr. Susanne Stutte for å ha lest manuskriptet.
Materials
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020)
- Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques–FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
