Sitokin Diferansiye İnsan Primer T Hücrelerinde Mitokondriyal Solunumun Gerçek Zamanlı İzlenmesi
Summary
Metabolik adaptasyon, farklılaşmayı, kalıcılığı ve sitotoksisiteyi belirlediği için T hücreleri için temeldir. Burada, ex vivo sitokin farklılaşmış insan primer T hücrelerinde mitokondriyal solunumu izlemek için optimize edilmiş bir protokol sunulmaktadır.
Abstract
Aktivasyon sırasında, T hücrelerinin metabolizması, kaderlerini etkileyen değişikliklere adapte olur. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyondaki artış, T hücresi aktivasyonu için vazgeçilmezdir ve hafıza T hücrelerinin hayatta kalması mitokondriyal yeniden şekillenmeye bağlıdır. Sonuç olarak, bu kanser immünoterapilerinin uzun vadeli klinik sonuçlarını etkiler. T hücre kalitesindeki değişiklikler genellikle doğrudan metabolik durumlarıyla değil, iyi bilinen yüzey belirteçleri kullanılarak akış sitometrisi ile incelenir. Bu, bir Hücre Dışı Akı Analizörü ve T hücresi metabolizmasını farklı şekilde etkileyen sitokinler IL-2 ve IL-15 kullanarak birincil insan T hücrelerinin gerçek zamanlı mitokondriyal solunumunu ölçmek için optimize edilmiş bir protokoldür. T hücrelerinin metabolik durumunun, metabolik yolaktaki anahtar kompleksleri inhibe ederken oksijen tüketiminin ölçülmesiyle açıkça ayırt edilebileceği ve bu ölçümlerin doğruluğunun optimal inhibitör konsantrasyonuna ve inhibitör enjeksiyon stratejisine büyük ölçüde bağlı olduğu gösterilmiştir. Bu standartlaştırılmış protokol, mitokondriyal solunumun kanser immünoterapilerinin izlenmesinde ve incelenmesinde T hücresi uygunluğu için bir standart olarak uygulanmasına yardımcı olacaktır.
Introduction
Doğru T hücresi gelişimi ve fonksiyonu, bağışıklık sisteminin antijenleri tanıma ve bunlara yanıt verme yeteneği için gereklidir. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon (OxPhos), T hücresinin durumuna göre değişir. Naif T hücreleri ağırlıklı olarak ATP üretmek için OxPhos kullanırken, aktive olmuş T hücreleri glikolizin baskın hale geldiği metabolik bir geçişe uğrar1. Efektör fazından sonra, bellek T hücrelerinin kalan küçük alt kümesi, OxPhos2,3’ün hakim olduğu metabolik bir duruma geri döner. OxPhos’un değişiklikleri, T hücrelerinin farklılaşmasını öyle bir dereceye kadar takip eder ki, T hücrelerinin alt kümeleri bile spesifik OxPhos özellikleri ile ayırt edilebilir1. Tersine, OxPhos, T hücrelerinin işlevi için önemlidir ve OxPhos’un inhibisyonunun, T hücrelerinin proliferasyonunu ve sitokin üretimini bloke ettiği gösterilmiştir4. Bu nedenle, T hücresi OxPhos’un özelliklerini kesin ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme yeteneği, T hücreleri ile çalışan herkes için güçlü bir araçtır.
Bu protokolde, T hücresi OxPhos’un özellikleri, hücre dışı bir akı analizörü kullanılarak ölçülür. Bu analizörün temel işlevi, analiz edilecek hücrelerin büyüme ortamının oksijen içeriğini sürekli olarak ölçmektir. Büyüme ortamından çıkarılan oksijenin hücreler tarafından alındığı varsayılır. Hücreleri çeşitli OxPhos inhibitörleri veya modifiye edicileri ile tedavi ederek, oksijen alımındaki bir düşüş, inhibe edilmiş veya modüle edilmiş fonksiyon ile ilişkilidir. Örneğin, ATP sentazının inhibisyonu, aksi takdirde oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretmek için kullanılacak olan hücresel oksijen alımının azalmasına yol açacaktır. Clark elektrodu ve Oroboros enstrümanı da dahil olmak üzere diğer ekipmanlar benzer işlevsellik sunar ve her enstrümanın farklı avantajları ve eksiklikleri vardır. Bu cihazlardaki çalışmalar için çok çeşitli hücre tipleri kullanılabilir, ancak özellikle zorlu bir hücre tipi insan primer T lenfositleridir5. Küçük boyutları, zayıf sağkalım ex vivo ve yapışkan olmayan özellikleri nedeniyle, insan birincil T hücrelerinin incelenmesi zor olabilir.
Bu, insan birincil T hücrelerinin mitokondriyal solunumunu hücre dışı bir analizör tarafından incelemek için bir protokoldür. Protokol, kuyu başına optimal hücre sayısı konsantrasyonlarının yanı sıra optimal oligomisin ve FCCP konsantrasyonunun belirlendiği bir Optimizasyon çalışmasına bölünmüştür. Ayrıca, optimize edilmiş koşulların kullanıldığı bir Tahlil çalışması.
Kan kaynaklı insan PBMC’lerini ve ex vivo primer T hücre kültürlerini kullanan bu protokol, optimal inhibitör konsantrasyonunun önemini ve hassas hücre tipleriyle çalışırken mitokondriyal inhibitörlerin sıralı enjeksiyonu yerine ayrı ayrı kullanılmasının önemini göstermektedir. Son olarak, bu tahlilin IL-2 ve IL-15 sitokinleri ile polarizasyon üzerine mitokondriyal solunumdaki ince farklılıkları sağlam bir şekilde tespit edebileceği gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oksidatif fosforilasyonun ayrıntılı ve doğru bir şekilde ölçülmesi, T hücrelerinin enerji durumlarını tanımlarken vazgeçilmez bir araçtır. Mitokondriyal uygunluk durumu, T hücresi aktivasyon potansiyeli, sağkalım ve farklılaşma ile doğrudan ilişkili olabilir1,5. Bu protokolle, oksidatif fosforilasyonun çeşitli özelliklerini belirlemek mümkündür (ayrıntılı bir açıklama için Tablo 4’e bakınız). Oksidatif fosforil…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Kasper Mølgaard ve Anne Rahbech, Tømmermester Jørgen Holm og Hustru Elisa f. Hansens Mindelegat’tan hibe aldı. Kasper Mølgaardayrıca Børnecancerfonden’den hibe aldı.
Materials
| 24-well tissue culture plate | Nunc | 142485 | |
| Anti-CD3xCD28 beads | Gibco | 11161D | |
| Antimycin A | Merck | A8674 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell-Tak | Corning | 354240 | For coating |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D9170 | |
| Human Serum | Sigma Aldrich | H4522 | Heat inactivated at 56 °C for 30 min |
| IL-15 | Peprotech | 200-02 | |
| IL-2 | Peprotech | 200-15 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 07801 | |
| Oligomycin | Merck | O4876 | |
| PBS | Thermo Fisher | 10010023 | |
| RPMI 1640 | Gibco-Thermo Fisher | 61870036 | |
| Seahorse Calibrant | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Seahorse XF 1.0 M glucose solution | Agilent Technologies | 103577-100 | |
| Seahorse XF 100 mM pytuvate solution | Agilent Technologies | 103578-100 | |
| Seahorse XF 200 mM glutamine solution | Agilent Technologies | 103579-100 | |
| Seahorse XF RPMI medium, pH7.4 | Agilent Technologies | 103576-100 | XF RPMI media |
| Seahorse XFe96 Analyser | Agilent Technologies | Flux analyzer | |
| Seahorse XFe96 cell culture microplates | Agilent Technologies | 102416-100 | XF cell culture plate |
| Seahorse XFe96 sensor cartridge | Agilent Technologies | 102416-100 | |
| Sodium Bicarbonate concentrate 0.1 M (NaHCO3) | Sigma Aldrich | 36486 | |
| Sodium Hydroxide solution 1 N (NaOH) | Sigma Aldrich | S2770-100ML | |
| X-VIVO 15 | Lonza | BE02-060F | |
| T cell beads magnet DynaMag-2 Magnet | Thermo Fisher | 12321D | |
| Seahorse wave | Flux analyzer software |
References
- vander Windt, G. J. W., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
- Krauss, S., Brand, M. D., Buttgereit, F. Signaling takes a breath–new quantitative perspectives on bioenergetics and signal transduction. Immunity. 15 (4), 497-502 (2001).
- vander Windt, G. J. W., et al. CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (35), 14336-14341 (2013).
- Chang, C. -. H., et al. Posttranscriptional control of T cell effector function by aerobic glycolysis. Cell. 153 (6), 1239-1251 (2013).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. -. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Current Protocols in Immunology. 113, 1-14 (2016).
- Buck, M. D., O’Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Rivadeneira, D. B., Delgoffe, G. M. Antitumor T-cell reconditioning: Improving metabolic fitness for optimal cancer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 24 (11), 2473-2481 (2018).
- Cieri, N., et al. IL-7 and IL-15 instruct the generation of human memory stem T cells from naive precursors. Blood. 121 (4), 573-584 (2013).
- Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
- Alizadeh, D., et al. IL15 enhances CAR-T cell antitumor activity by reducing mTORC1 activity and preserving their stem cell memory phenotype. Cancer Immunology Research. 7 (5), 759-772 (2019).
