뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석
Summary
이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.
Abstract
호흡기는 외부 환경과 직접 접촉하며 환경 항원에 대한 원치 않는 반응을 억제하면서 보호를 제공하기 위해 정밀하게 조절된 면역 체계가 필요합니다. 폐는 면역 감시를 제공하지만 보호 면역 반응을 매개하는 선천적 및 적응 면역 세포의 여러 집단을 호스트합니다. 건강한 폐 면역 체계의 균형을 유지하는 이러한 세포는 천식, 감염, 자가면역 질환 및 암과 같은 여러 병리학 적 상태에도 참여합니다. 표면 및 세포내 단백질의 선택적 발현은 폐의 면역 세포에 독특한 면역표현형 특성을 제공한다. 결과적으로, 유세포 측정은 정상 상태 및 병리학 적 조건 동안 그러한 세포 집단의 확인에 중요한 역할을합니다. 이 논문은 정상 상태 조건 하에서 건강한 마우스의 폐에 상주하는 면역 세포를 확인하기위한 일관되고 재현 가능한 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 그러나, 이 프로토콜은 또한 폐 면역 환경에서 질환 특이적 변화를 식별하는 것을 돕기 위해 다양한 질병 모델에서 이들 세포 집단의 변화를 확인하는데 사용될 수 있다.
Introduction
뮤린 호흡기에는 병원균과 싸우고 면역 항상성을 유지하는 독특한 면역 체계가 포함되어 있습니다. 폐 면역 체계는 표현형, 기능, 기원 및 위치에서 상당한 이질성을 가진 세포 집단으로 구성됩니다. 상주 폐포 대식세포 (AMs)는 주로 태아 단핵구에서 유래하여 폐포 루멘1에 상주하며, 골수 유래 간질성 대식세포 (IMs)는 폐 실질2에 상주합니다. IMs는 CD206의 발현에 의해 추가로 하위분류될 수 있다. CD206+ IM은 기관지 주위 및 혈관주위 영역을 채우는 반면, CD206-IM은 폐포 간질3에 위치한다. IM의 몇 가지 하위 분류가 최근에 제안되었습니다 3,4,5,6. IM이 AM보다 덜 연구되었지만, 최근의 증거는 폐의 면역 체계 조절에 중요한 역할을지지합니다7. 또한, CD206은 또한 대안적으로 활성화된 AMs8에서 발현된다.
폐 수지상 세포 (DCs)는 폐 면역 세포의 또 다른 이종 그룹으로서 그들의 기능적 특성, 위치 및 기원과 관련하여 존재한다. DC의 네 가지 하위 범주가 폐에 기술되었다: 통상적인 CD103+ DCs(cDC1로도 알려짐), 통상적인 CD11b+ DCs(cDC2로도 알려짐), 단핵구 유래 DCs(MoDCs), 및 혈장세포성 DCs9,10,11,12,13. 처음 세 개의 서브클래스는 주조직 적합성 복합체(MHC) II+CD11c+9,10,14,15로 정의될 수 있다. 플라스마사이토이드 DC는 MHC II를 발현하고 CD11c에 대해 중간 양성이지만 높은 수준의 B220 및 PDCA-19,13,16을 발현한다. 순진한 뮤린 폐에서 CD103 DC와 CD11b DC는 기도 간질에 위치하는 반면, 혈장 세포질 DC는 폐포 간질에 위치합니다17.
단핵구의 두 가지 주요 집단은 정상 상태 동안 폐에 거주합니다 : 고전적인 단핵구와 비 고전적 단핵구. 고전적 단핵구는 Ly6C+이며 초기 염증 반응에 매우 중요합니다. 대조적으로, 비고전적 단핵구는 Ly6C-항염증 세포3,16,18로서 널리 간주되어 왔다. 최근에, CD64+CD16.2+ 단핵구의 추가 집단이 기술되었고, 이는 Ly6C-단핵구로부터 기원하고 CD206+ IMs3를 야기한다.
호산구는 주로 기생충 감염이나 알레르기 상태 동안 폐에 나타납니다. 그러나, 정상 상태 동안 폐 실질에는 소수의 호산구가 존재하며, 이는 상주 호산구로 알려져 있다. 상주 호산구와는 달리, 염증성 호산구는 폐 간질염 및 기관지 폐포 세척 (BAL)에서 발견됩니다. 집먼지 진드기 (HDM)의 마우스 모델에서, 염증성 호산구는 항원 매개 자극 후 폐로 모집된다. 상주 호산구는 HDM19에 대한 T 헬퍼 2 (Th2) 감작을 억제함으로써 알레르기에 대한 조절 역할을 할 수 있다고 제안되었습니다.
나머지 폐 골수성 세포와는 달리, 호중구는 CD68이 아닌 Ly6G를 발현하며 CD68-Ly6G+ 면역표현형16,20,21의 시그니처를 특징으로 한다. 시각화 연구는 정상 상태 동안, 폐는 혈관내 구획에 호중구 풀을 보유하고, 상당한 수의 혈관외 호중구를 숙주로 한다는 것을 보여주었다22. 호산구와 유사하게, 호중구는 정상 상태에서 BAL에서 발견되지 않는다; 그러나 LPS 챌 린지, 천식 또는 폐렴과 같은 여러 형태의 면역 자극은 호중구를 폐포 내강으로 유도하여 BAL21,22,23에 존재하게됩니다.
폐의 상당한 수의 CD45+ 세포는 자연 살해 (NK), T 세포, 및 B 세포를 나타내며, 대부분의 골수성 마커24에 대해 음성이다. 순진한 마우스의 폐에서, 이들 세 가지 세포 유형은 CD11b 및 MHC II18의 발현에 기초하여 확인될 수 있다. 폐 CD45+ 세포의 약 25%는 B 세포인 반면, NK 세포의 비율은 다른 림프성 및 비림프성 조직보다 폐에서 더 높다24,25,26. 폐 T 세포 중에서, 상당한 분획은 CD4-CD8–호흡기 감염26에서 중요한 역할을 한다.
폐는 매우 복잡하고 독특한 면역 체계를 보유하고 있기 때문에 폐 면역 세포의 확인을위한 몇 가지 게이팅 전략이 개발되어 16,18,20,27보고되었습니다. 본원에 기재된 게이팅 전략은 9개의 마커를 사용하여 최대 12개의 상이한 폐 골수성 및 비골수성 면역 집단을 확인하기 위한 포괄적이고 재현가능한 방법을 제공한다. 결과의 유효성을 검사하기 위해 추가 마커가 사용되었습니다. 또한, 세포 사멸을 최소화하고 폐의 면역 세포 구획의 가장 완전한 프로파일의 확인을 허용하는 단일 세포 현탁액의 제조를 위한 상세한 방법이 제공된다. 상피 세포 (CD45-CD326+CD31-), 내피 세포 (CD45-CD326-CD31+), 및 섬유아세포와 같은 폐의 비면역 세포의 동정은 상이한 접근법을 필요로 한다는 점에 유의해야 한다28,29. 이러한 집단의 확인은 여기에 설명된 프로토콜 및 방법에 포함되지 않는다.
Protocol
Representative Results
Discussion
폐 면역 세포의 확인은 폐에 상주하는 여러 면역 세포 유형과 다른 조직에 거주하는 상대편에 비해 독특한 면역 표현형 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 여러 병리학 적 조건에서 뚜렷한 표현형 특징을 가진 세포가 폐에 나타납니다. 예를 들어, 블레오마이신-유도된 폐 손상은 폐포 공간에서 순환하는 단핵구 유래 대식세포의 모집을 초래하며, 여기서 이들은 일년 동안 남아있을 수 있고 심지어 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 R01CA238263 및 R01CA229784 (VAB)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
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