Flowcytometrisk analyse til identifikation af de medfødte og adaptive immunceller i Murine Lung

Summary

I denne undersøgelse præsenterer vi en effektiv og reproducerbar protokol til at isolere immunpopulationerne i murine åndedrætssystemet. Vi leverer også en metode til identifikation af alle medfødte og adaptive immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus, ved hjælp af et 9-farvebaseret flowcytometripanel.

Abstract

Luftvejene er i direkte kontakt med det ydre miljø og kræver et præcist reguleret immunsystem for at yde beskyttelse, samtidig med at uønskede reaktioner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vært for flere populationer af medfødte og adaptive immunceller, der giver immunovervågning, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse celler, som holder det sunde lungeimmunsystem i balance, deltager også i flere patologiske tilstande som astma, infektioner, autoimmune sygdomme og kræft. Selektiv ekspression af overflade- og intracellulære proteiner giver unikke immunofænotypiske egenskaber til lungens immunceller. Følgelig har flowcytometri en instrumentel rolle i identifikationen af sådanne cellepopulationer under steady-state og patologiske tilstande. Dette papir præsenterer en protokol, der beskriver en konsekvent og reproducerbar metode til at identificere de immunceller, der befinder sig i lungerne hos raske mus under steady-state betingelser. Denne protokol kan dog også bruges til at identificere ændringer i disse cellepopulationer i forskellige sygdomsmodeller for at hjælpe med at identificere sygdomsspecifikke ændringer i lungeimmunlandskabet.

Introduction

Murine luftvejene indeholder et unikt immunsystem, der er ansvarligt for at bekæmpe patogener og opretholde immunhomeostase. Lungeimmunsystemet består af cellulære populationer med signifikant heterogenitet i deres fænotype, funktion, oprindelse og placering. Residente alveolære makrofager (AMs), der hovedsagelig stammer fra føtale monocytter, befinder sig i det alveolære ^lumen1, mens knoglemarvsafledte interstitielle makrofager (IM’er) befinder sig i lungeparenchyma2. IM’er kan yderligere underklassificeres ved hjælp af udtrykket CD206. CD206⁺ IM’er befolker det peribronchiale og perivaskulære område, mens CD206^– IM’er er placeret ved det alveolære interstitium3. Et par underklassifikationer af IM’er er blevet foreslået for nylig3,4,5,6. Selvom IM’er er mindre undersøgt end AMs, understøtter de seneste beviser deres afgørende rolle i reguleringen af immunsystemet i ^lungen7. Derudover udtrykkes CD206 også i alternativt aktiverede ^AMs8.

Pulmonale dendritiske celler (LLC’er) er en anden heterogen gruppe af lungeimmunceller med hensyn til deres funktionelle egenskaber, placering og oprindelse. Fire underkategorier af DC’er er blevet beskrevet i lungen: konventionelle CD103 ⁺ DC’er (også kendt som cDC1), konventionelle CD11b ⁺ DC’er (også kendt som cDC2), monocytafledte DC’er (MoDC’er) og plasmacytoid DC’er9,10,11,12,13. De første tre underklasser kan defineres som major histocompatibility complex (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Plasmacytoid-DCs udtrykker MHC II og er mellemliggende positive for CD11c, men udtrykker høje niveauer af B220 og PDCA-19,13,16. I naive murinlunger er CD103DC’er og CD11bDC’er placeret i luftvejsinterstitiumet, mens plasmacytoid-LLC’er er placeret i det alveolære ^{interstitium17}.

To store populationer af monocytter befinder sig i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C ⁺ og er kritiske for det indledende inflammatoriske respons. I modsætning hertil er ikke-klassiske monocytter Ly6C^– og er blevet bredt betragtet som antiinflammatoriske celler3,16,18. For nylig blev en yderligere population af CD64 ⁺ CD16.2⁺ monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C-monocytter og giver anledning til CD206^{+ IMs3}.

Eosinofiler forekommer hovedsageligt i lungerne under helminthinfektion eller allergiske tilstande. Der er dog et lille antal eosinofiler i lungeparenchymen under steady state, kendt som bosiddende eosinofiler. I modsætning til de bosiddende eosinofiler findes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronchoalveolær skylning (BAL). I musemodeller af husstøvmide (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungen efter antigenmedieret stimulering. Det er blevet foreslået, at hjemmehørende eosinofiler kan have en regulerende rolle i allergi ved at hæmme T-hjælper 2 (Th2) sensibilisering over for ^HDM19.

I modsætning til resten af lunge myeloide celler udtrykker neutrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er kendetegnet ved en signatur af CD68-Ly6G ⁺ immunophenotype16,20,21. Visualiseringsundersøgelser har vist, at lungen under steady state reserverer en pulje neutrofiler i det intravaskulære rum og er vært for et betydeligt antal ekstravaskulære ^{neutrofiler22}. I lighed med eosinofiler findes neutrofiler ikke i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, såsom LPS-udfordring, astma eller lungebetændelse, neutrofiler ind i det alveolære lumen, hvilket resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.

Et betydeligt antal CD45^+-celler i lungen repræsenterer naturlige dræberceller (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloide ^markører24. I lungerne hos naive mus kan disse tre celletyper identificeres ud fra ekspressionen af CD11b og MHC ^II18. Omkring 25% af lunge-CD45⁺ cellerne er B-celler, mens procentdelen af NK-celler er højere i lungen end andre lymfoide og ikke-lymfoide væv24,25,26. Blandt ^{lunge-T-celler} er en betydelig brøkdel CD4-CD8^– og spiller en vigtig rolle i luftvejsinfektioner26.

Fordi lungen er vært for et meget komplekst og unikt immunsystem, er der udviklet og rapporteret flere gating strategier til identifikation af lungeimmunceller16,18,20,27. Gating-strategien beskrevet heri giver en omfattende og reproducerbar måde at identificere op til 12 forskellige lunge myeloide og ikke-myeloide immunpopulationer ved hjælp af 9 markører. Yderligere markører er blevet brugt til at validere resultaterne. Desuden er der tilvejebragt en detaljeret metode til fremstilling af en enkeltcellesuspension, der minimerer celledød og muliggør identifikation af den mest komplette profil af lungens immuncellerum. Det skal bemærkes, at identifikationen af ikke-immune celler i lungen, såsom epitelceller (CD45-CD326 ⁺ CD31^–), endotelceller (CD45-CD326-CD31⁺) og fibroblaster kræver en anden ^tilgang28,29. Identifikation af sådanne populationer er ikke inkluderet i protokollen og metoden beskrevet her.

Protocol

Alle undersøgelser og eksperimenter beskrevet i denne protokol blev udført under retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Beth Israel Deaconess Medical Center. Seks til ti uger gamle C57BL/6 mus af begge køn blev brugt til at udvikle denne protokol. 1. Kirurgisk udskæring og vævsforberedelse Aflive musen ved intraperitonealt at injicere 1 ml tribromethanol (fremstillet i henhold til standardprotokollen; Tabel over materialer</s…

Representative Results

Gating strategiDet første skridt i vores gating-strategi er udelukkelsen af snavs og doublets (figur 1A). Omhyggelig udelukkelse af doublets er afgørende for at undgå falsk-positive populationer (supplerende figur S2). Derefter identificeres immunceller ved hjælp af CD45 +, en markør for hæmatopoietiske celler (figur 1B). Den levende-døde plet kan tilføjes for at udelukke døde celler. Denne protokol resul…

Discussion

Identifikation af lungeimmunceller kan være udfordrende på grund af de mange immuncelletyper, der bor i lungen og deres unikke immunophenotypiske egenskaber sammenlignet med deres modparter, der bor i andre væv. Under flere patologiske tilstande forekommer celler med forskellige fænotypiske træk i lungerne. For eksempel resulterer bleomycin-induceret lungeskade i rekruttering af cirkulerende monocytafledte makrofager i det alveolære rum, hvor de kan forblive i så længe som et år og endda fortsætte efter bleomyc…

Materials

10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co