Flowcytometrische analyse voor identificatie van de aangeboren en adaptieve immuuncellen van muizenlong
Summary
In deze studie presenteren we een effectief en reproduceerbaar protocol om de immuunpopulaties van het muriene ademhalingssysteem te isoleren. We bieden ook een methode voor de identificatie van alle aangeboren en adaptieve immuuncellen die zich in de longen van gezonde muizen bevinden, met behulp van een op 9 kleuren gebaseerd flowcytometriepaneel.
Abstract
De luchtwegen staan in direct contact met de externe omgeving en vereisen een nauwkeurig gereguleerd immuunsysteem om bescherming te bieden en tegelijkertijd ongewenste reacties op omgevingsantigenen te onderdrukken. Longen herbergen verschillende populaties van aangeboren en adaptieve immuuncellen die immuunsurveillance bieden, maar ook beschermende immuunresponsen bemiddelen. Deze cellen, die het gezonde pulmonale immuunsysteem in balans houden, nemen ook deel aan verschillende pathologische aandoeningen zoals astma, infecties, auto-immuunziekten en kanker. Selectieve expressie van oppervlakte- en intracellulaire eiwitten biedt unieke immunofenotypische eigenschappen aan de immuuncellen van de long. Bijgevolg speelt flowcytometrie een instrumentele rol bij de identificatie van dergelijke celpopulaties tijdens steady-state en pathologische omstandigheden. Dit artikel presenteert een protocol dat een consistente en reproduceerbare methode beschrijft om de immuuncellen te identificeren die zich in de longen van gezonde muizen bevinden onder steady-state omstandigheden. Dit protocol kan echter ook worden gebruikt om veranderingen in deze celpopulaties in verschillende ziektemodellen te identificeren om ziektespecifieke veranderingen in het longimmuunlandschap te helpen identificeren.
Introduction
De muizenweg bevat een uniek immuunsysteem dat verantwoordelijk is voor het bestrijden van ziekteverwekkers en het handhaven van immuunhomeostase. Het pulmonale immuunsysteem bestaat uit cellulaire populaties met een significante heterogeniteit in hun fenotype, functie, oorsprong en locatie. Residente alveolaire macrofagen (AM’s), voornamelijk afkomstig van foetale monocyten, bevinden zich in het alveolaire lumen1, terwijl van beenmerg afgeleide interstitiële macrofagen (IM’s) zich in het longparenchym bevinden2. IM’s kunnen verder worden gesubclassificeerd door de expressie van CD206. CD206+ IM’s bevolken het peribronchiale en perivasculaire gebied, terwijl CD206-IM’s zich bevinden op het alveolaire interstitium3. Onlangs zijn enkele subclassificaties van im’s voorgesteld3,4,5,6. Hoewel IM’s minder worden bestudeerd dan AM’s, ondersteunt recent bewijs hun cruciale rol in de regulatie van het immuunsysteem van de long7. Daarnaast wordt CD206 ook uitgedrukt in alternatief geactiveerde AMs8.
Pulmonale dendritische cellen (DC’s) zijn een andere heterogene groep longimmuuncellen met betrekking tot hun functionele eigenschappen, locatie en oorsprong. Vier subcategorieën van DC’s zijn beschreven in de longen: conventionele CD103 + DC’s (ook bekend als cDC1), conventionele CD11b + DC’s (ook bekend als cDC2), monocyt-afgeleide DC’s (MoDC’s) en plasmacytoïde DC’s9,10,11,12,13. De eerste drie subklassen kunnen worden gedefinieerd als major histocompatibility complex (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoïde DC’s drukken MHC II uit en zijn gemiddeld positief voor CD11c, maar drukken hoge niveaus van B220 en PDCA-19,13,16 uit. In naïeve muizenlongen bevinden CD103 DC’s en CD11b DC’s zich in het luchtweginterstitium, terwijl plasmacytoïde DC’s zich in het alveolaire interstitium17 bevinden.
Twee belangrijke populaties van monocyten verblijven in de longen tijdens steady state: klassieke monocyten en niet-klassieke monocyten. Klassieke monocyten zijn Ly6C+ en zijn van cruciaal belang voor de initiële ontstekingsreactie. Daarentegen zijn niet-klassieke monocyten Ly6C– en worden ze algemeen beschouwd als ontstekingsremmende cellen3,16,18. Onlangs werd een extra populatie cd64+cd16,2+ monocyten beschreven, die afkomstig zijn van Ly6C-monocyten en aanleiding geven tot CD206+ IM’s3.
Eosinofielen verschijnen voornamelijk in de longen tijdens worminfectie of allergische aandoeningen. Er is echter een klein aantal eosinofielen in het pulmonale parenchym tijdens steady state, bekend als resident eosinofielen. In tegenstelling tot de resident eosinofielen worden inflammatoire eosinofielen gevonden in het longinterstitium en bronchoalveolaire lavage (BAL). In muismodellen van huisstofmijt (HDM) worden inflammatoire eosinofielen in de longen gerekruteerd na antigeen-gemedieerde stimulatie. Er is voorgesteld dat resident eosinofielen een regulerende rol kunnen spelen bij allergie door T-helper 2 (Th2) sensibilisatie voor HDM19 te remmen.
In tegenstelling tot de rest van de myeloïde longcellen, drukken neutrofielen Ly6G uit, maar niet CD68 en worden gekenmerkt door een signatuur van het CD68-Ly6G+ immunofenotype16,20,21. Visualisatiestudies hebben aangetoond dat tijdens steady state de longen een pool van neutrofielen in het intravasculaire compartiment reserves en een aanzienlijk aantal extravasculaire neutrofielen host22. Net als eosinofielen worden neutrofielen niet gevonden in BAL bij steady state; verschillende vormen van immuunstimulatie, zoals LPS-uitdaging, astma of longontsteking, drijven neutrofielen echter in het alveolaire lumen, wat resulteert in hun aanwezigheid in BAL21,22,23.
Een aanzienlijk aantal CD45+ cellen van de long vertegenwoordigen natural killer (NK), T-cellen en B-cellen en zijn negatief voor de meeste myeloïde markers24. In de longen van naïeve muizen kunnen deze drie celtypen worden geïdentificeerd op basis van de expressie van CD11b en MHC II18. Ongeveer 25% van de pulmonale CD45+ cellen zijn B-cellen, terwijl het percentage NK-cellen hoger is in de longen dan andere lymfoïde en niet-lymfoïde weefsels24,25,26. Onder pulmonale T-cellen is een aanzienlijk deel CD4-CD8– en speelt een belangrijke rol bij luchtweginfecties26.
Omdat de long een zeer complex en uniek immuunsysteem herbergt, zijn verschillende gatingstrategieën voor de identificatie van longimmuuncellen ontwikkeld en gerapporteerd16,18,20,27. De hierin beschreven gating-strategie biedt een uitgebreide en reproduceerbare manier om tot 12 verschillende pulmonale myeloïde en niet-myeloïde immuunpopulaties te identificeren met behulp van 9 markers. Extra markers zijn gebruikt om de resultaten te valideren. Bovendien wordt een gedetailleerde methode geboden voor de bereiding van een eencellige suspensie die celdood minimaliseert en de identificatie van het meest complete profiel van het immuuncelcompartiment van de long mogelijk maakt. Opgemerkt moet worden dat de identificatie van niet-immuuncellen van de long, zoals epitheelcellen (CD45-CD326 + CD31–), endotheelcellen (CD45-CD326-CD31 +), en fibroblasten een andere aanpak vereist28,29. Identificatie van dergelijke populaties is niet opgenomen in het protocol en de methode die hier worden beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identificatie van pulmonale immuuncellen kan een uitdaging zijn vanwege de meerdere immuunceltypen die zich in de longen bevinden en hun unieke immunofenotypische kenmerken in vergelijking met hun tegenhangers die in andere weefsels verblijven. Bij verschillende pathologische aandoeningen verschijnen cellen met verschillende fenotypische kenmerken in de longen. Bleomycine-geïnduceerde longbeschadiging resulteert bijvoorbeeld in de rekrutering van circulerende monocyt-afgeleide macrofagen in de alveolaire ruimte, waar ze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R01CA238263 en R01CA229784 (VAB).
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
