ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין
Summary
במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.
Abstract
מערכת הנשימה נמצאת במגע ישיר עם הסביבה החיצונית ודורשת מערכת חיסונית מוסדרת במדויק כדי לספק הגנה תוך דיכוי תגובות לא רצויות לאנטיגנים סביבתיים. הריאות מארחות מספר אוכלוסיות של תאי חיסון מולדים ומסתגלים המספקים מעקב חיסוני אך גם מתווכים בתגובות חיסוניות מגנות. תאים אלה, השומרים על איזון מערכת החיסון הריאתית הבריאה, משתתפים גם במספר מצבים פתולוגיים כגון אסתמה, זיהומים, מחלות אוטואימוניות וסרטן. ביטוי סלקטיבי של חלבונים פנימיים ותאיים מספק תכונות חיסוניות ייחודיות לתאי החיסון של הריאה. כתוצאה מכך, לציטומטריית זרימה יש תפקיד אינסטרומנטלי בזיהוי אוכלוסיות תאים כאלה במהלך מצב יציב ותנאים פתולוגיים. מאמר זה מציג פרוטוקול המתאר שיטה עקבית וניתנת לשחזור לזיהוי תאי החיסון השוכנים בריאות של עכברים בריאים בתנאים יציבים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לזהות שינויים באוכלוסיות תאים אלה במודלים שונים של מחלות כדי לסייע בזיהוי שינויים ספציפיים למחלות בנוף מערכת החיסון של הריאות.
Introduction
דרכי הנשימה של מורין מכילות מערכת חיסונית ייחודית האחראית למלחמה בפתוגנים ולשמירה על הומאוסטזיס חיסוני. מערכת החיסון הריאתית מורכבת מאוכלוסיות תאיות עם הטרוגניות משמעותית בפנוטיפ, בתפקוד, במקור ובמיקום שלהן. מקרופאגים מכתשיים מקומיים (AMs), שמקורם בעיקר במונוציטים עובריים, שוכנים בלומן מכתשי1, בעוד שמקרופגים ביניים (IMs) שמקורם במח העצם שוכנים בפרנצ’ימה הריאה2. הודעות מיידיות יכולות להיות מסווגות עוד יותר על-ידי הביטוי של CD206. CD206+ IMs מאכלסים את אזור הפריברונכיאל והפריקולרי, בעוד ש- CD206– IMs ממוקמים באינטרסטיטיום מכתשי3. כמה מחלקות משנה של הודעות מיידיות הוצעו לאחרונה3,4,5,6. למרות IMs נחקרים פחות מאשר AMs, ראיות אחרונות תומכות בתפקיד המכריע שלהם בוויסות המערכת החיסונית של הריאה7. בנוסף, CD206 מתבטא גם ב- AMs8 המופעלים באופן חלופי.
תאי דנדריטי ריאתי (DCs) הם קבוצה הטרוגנית נוספת של תאי מערכת החיסון של הריאות ביחס למאפיינים התפקודיים שלהם, מיקומם ומוצאם. ארבע קטגוריות משנה של DCs תוארו בריאה: CD103 + DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC1), CD11b + DCs קונבנציונליים (הידועים גם בשם cDC2), בקרי DC (MoDCs) שמקורם במונוציטים ו- DC של פלסמציטויד9,10,11,12,13. ניתן להגדיר את שלוש מחלקות המשנה הראשונות כתרכובת היסטו-תאימות מרכזית (MHC) II +CD11c+9,10,14,15. מחשבי DCs פלזמה מבטאים MHC II והם חיוביים באופן ביניים עבור CD11c אך מבטאים רמות גבוהות של B220 ו- PDCA-19,13,16. בריאות מורין נאיביות, CD103 DCs ו- CD11b DCs ממוקמים interstitium דרכי הנשימה, בעוד DCs plasmacytoid ממוקמים interstitium מכתשי17.
שתי אוכלוסיות עיקריות של מונוציטים שוכנות בריאה במצב יציב: מונוציטים קלאסיים ומונוציטים לא קלאסיים. מונוציטים קלאסיים הם Ly6C+ והם קריטיים לתגובה הדלקתית הראשונית. לעומת זאת, מונוציטים לא קלאסיים הם Ly6C– והם נתפסו באופן נרחב כתאים אנטי דלקתיים3,16,18. לאחרונה תוארה אוכלוסייה נוספת של מונוציטים CD64+CD16.2+CD16.2+, שמקורם ב- Ly6C– מונוציטים ומעוררים CD206 + IMs3.
אאוזינופילים מופיעים בעיקר בריאות במהלך זיהום הלמינת או תנאים אלרגיים. עם זאת, יש מספר קטן של אאוזינופילים בפרנצ’ימה ריאתית במהלך מצב יציב, המכונה אאוזינופילים תושב. בניגוד לאאוזינופילים המקומיים, אאוזינופילים דלקתיים נמצאים באינטרסטיטיום הריאות ובשטיפה סימפונלבולרית (BAL). במודלים של עכבר של קרדית אבק הבית (HDM), אאוזינופילים דלקתיים מגויסים לריאה לאחר גירוי בתיווך אנטיגן. הוצע כי אאוזינופילים תושב עשוי להיות תפקיד רגולטורי באלרגיה על ידי עיכוב T helper 2 (Th2) רגישות HDM19.
בניגוד לשאר תאי המיאלואידים הריאתיים, נויטרופילים מבטאים Ly6G אך לא CD68 ומאופיינים בחתימה של ה- CD68-Ly6G + אימונופנוטיפ16,20,21. מחקרי הדמיה הראו כי במהלך מצב יציב, הריאה שומרת מאגר של נויטרופילים בתא התוך וסקולרי ומארחת מספר ניכר של נויטרופילים חוץ וסקולריים22. בדומה לאאוזינופילים, נויטרופילים אינם נמצאים ב- BAL במצב יציב; עם זאת, מספר צורות של גירוי חיסוני, כגון אתגר LPS, אסטמה, או דלקת ריאות, לנהוג נויטרופילים לתוך לומן מכתשי, וכתוצאה מכך נוכחותם BAL21,22,23.
מספר משמעותי של תאי CD45+ של הריאה מייצגים רוצח טבעי (NK), תאי T ותאי B והם שליליים עבור רוב סמני המיאלואידים24. בריאות של עכברים נאיביים, ניתן לזהות את שלושת סוגי התאים האלה בהתבסס על הביטוי של CD11b ו- MHC II18. כ-25% מתאי CD45+ הריאתיים הם תאי B, בעוד שאחוז תאי ה-NK גבוה יותר בריאה מאשר רקמות לימפואידיות ולא לימפואידיות אחרות24,25,26. בקרב תאי T ריאתיים, שבר ניכר הוא CD4-CD8– וממלא תפקיד חשוב בזיהומים בדרכי הנשימה26.
מכיוון שהריאה מארחת מערכת חיסונית מורכבת וייחודית מאוד, פותחו מספר אסטרטגיות gating לזיהוי תאי מערכת החיסון של הריאות ודווחו על 16,18,20,27. אסטרטגיית ההמצאה המתוארת במסמך זה מספקת דרך מקיפה וניתנת לשחזור לזהות עד 12 אוכלוסיות מיאלואידיות ריאתיות שונות ומערכת חיסונית לא מיאלואידית באמצעות 9 סמנים. סמנים נוספים שימשו לאימות התוצאות. יתר על כן, שיטה מפורטת מסופקת להכנת השעיה של תא יחיד הממזערת את מוות התאים ומאפשרת זיהוי של הפרופיל השלם ביותר של תא התא החיסוני של הריאה. יש לציין כי זיהוי של תאים שאינם חיסוניים של הריאה, כגון תאי אפיתל (CD45-CD326 +CD31–), תאי אנדותל (CD45-CD326-CD31+), ופיברובלסטים דורש גישה שונה 28,29. זיהוי אוכלוסיות כאלה אינו כלול בפרוטוקול ובשיטה המתוארים כאן.
Protocol
Representative Results
Discussion
זיהוי של תאי מערכת החיסון הריאתית יכול להיות מאתגר בגלל סוגי תאי החיסון המרובים המתגוררים בריאה ומאפייניהם החיסוניים הייחודיים בהשוואה למקביליהם המתגוררים ברקמות אחרות. במספר מצבים פתולוגיים, תאים עם תכונות פנוטיפיות ברורות מופיעים בריאות. לדוגמה, פגיעה ריאות הנגרמת על ידי בלומיצין גו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R01CA238263 ו R01CA229784 (VAB).
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
- Guilliams, M., et al. Alveolar macrophages develop from fetal monocytes that differentiate into long-lived cells in the first week of life via GM-CSF. Journal of Experimental Medicine. 210 (10), 1977-1992 (2013).
- Tan, S. Y., Krasnow, M. A. Developmental origin of lung macrophage diversity. Development. 143 (8), 1318-1327 (2016).
- Schyns, J., et al. Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung. Nature Communications. 10 (1), 3964 (2019).
- Gibbings, S. L., et al. Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).
- Ural, B. B., et al. Identification of a nerve-associated, lung-resident interstitial macrophage subset with distinct localization and immunoregulatory properties. Science Immunology. 5 (45), 8756 (2020).
- Chakarov, S., et al. Two distinct interstitial macrophage populations coexist across tissues in specific subtissular niches. Science. 363 (6432), (2019).
- Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, C. J., Marichal, T., Bureau, F. The interstitial macrophage: A long-neglected piece in the puzzle of lung immunity. Cellular Immunology. 330, 91-96 (2018).
- Stouch, A. N., et al. IkappaB kinase activity drives fetal lung macrophage maturation along a non-M1/M2 paradigm. Journal of Immunology. 193 (3), 1184-1193 (2014).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Liu, H., et al. Dendritic cell trafficking and function in rare lung diseases. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (4), 393-402 (2017).
- Cook, P. C., MacDonald, A. S. Dendritic cells in lung immunopathology. Seminars in Immunopathology. 38, 449-460 (2016).
- Guilliams, M., Lambrecht, B. N., Hammad, H. Division of labor between lung dendritic cells and macrophages in the defense against pulmonary infections. Mucosal Immunology. 6 (3), 464-473 (2013).
- Nobs, S. P., et al. PPARγ in dendritic cells and T cells drives pathogenic type-2 effector responses in lung inflammation. Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 3015-3035 (2017).
- Aegerter, H., et al. Influenza-induced monocyte-derived alveolar macrophages confer prolonged antibacterial protection. Nature Immunology. 21 (2), 145-157 (2020).
- Misharin, A. V., Morales-Nebreda, L., Mutlu, G. M., Budinger, G. R., Perlman, H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (4), 503-510 (2013).
- Hoffmann, F. M., et al. Distribution and interaction of murine pulmonary phagocytes in the naive and allergic lung. Frontiers in Immunology. 9, 1046 (2018).
- Yu, Y. R., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLoS One. 11 (3), 0150606 (2016).
- Mesnil, C., et al. Lung-resident eosinophils represent a distinct regulatory eosinophil subset. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3279-3295 (2016).
- Zaynagetdinov, R., et al. Identification of myeloid cell subsets in murine lungs using flow cytometry. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 180-189 (2013).
- Tavares, A. H., Colby, J. K., Levy, B. D., Abdulnour, R. E. A model of self-limited acute lung injury by unilateral intra-bronchial acid instillation. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e60024 (2019).
- Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (42), 18073-18078 (2010).
- Krishnamoorthy, N., et al. Neutrophil cytoplasts induce TH17 differentiation and skew inflammation toward neutrophilia in severe asthma. Science Immunology. 3 (26), (2018).
- Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. Journal of Leukocyte Biology. 84 (6), 1400-1409 (2008).
- Wang, J., et al. Lung natural killer cells in mice: phenotype and response to respiratory infection. Immunology. 137 (1), 37-47 (2012).
- Cowley, S. C., Meierovics, A. I., Frelinger, J. A., Iwakura, Y., Elkins, K. L. Lung CD4-CD8- double-negative T cells are prominent producers of IL-17A and IFN-gamma during primary respiratory murine infection with Francisella tularensis live vaccine strain. Journal of Immunology. 184 (10), 5791-5801 (2010).
- Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V., Alper, S., Janssen, W. Isolation and characterization of mononuclear phagocytes in the mouse lung and lymph nodes. In Lung innate immunity and inflammation. Methods in Molecular Biology. 1809, (2018).
- Singer, B. D., et al. Flow-cytometric method for simultaneous analysis of mouse lung epithelial, endothelial, and hematopoietic lineage cells. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 310 (9), 796-801 (2016).
- Matsushima, S., et al. CD248 and integrin alpha-8 are candidate markers for differentiating lung fibroblast subtypes. BMC Pulmonary Medicine. 20 (1), 21 (2020).
- Cong, J., Wei, H. Natural killer cells in the lungs. Frontiers in Immunology. 10, 1416 (2019).
- Daubeuf, F., et al. A fast, easy, and customizable eight-color flow cytometric method for analysis of the cellular content of bronchoalveolar lavage fluid in the mouse. Current Protocols in Mouse Biology. 7 (2), 88-99 (2017).
- Yi, S., et al. Eosinophil recruitment is dynamically regulated by interplay among lung dendritic cell subsets after allergen challenge. Nature Communications. 9 (1), 3879 (2018).
- Langlet, C., et al. CD64 expression distinguishes monocyte-derived and conventional dendritic cells and reveals their distinct role during intramuscular immunization. Journal of Immunology. 188 (4), 1751-1760 (2012).
- Moran, T. P., Nakano, H., Kondilis-Mangum, H. D., Wade, P. A., Cook, D. N. Epigenetic control of Ccr7 expression in distinct lineages of lung dendritic cells. Journal of Immunology. 193 (10), 4904-4913 (2014).
- Schyns, J., Bureau, F., Marichal, T. Lung interstitial macrophages: past, present, and future. Journal of Immunology Research. 2018, 5160794 (2018).
- Krljanac, B., et al. RELMalpha-expressing macrophages protect against fatal lung damage and reduce parasite burden during helminth infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
- Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
- Svedberg, F. R., et al. The lung environment controls alveolar macrophage metabolism and responsiveness in type 2 inflammation. Nature Immunology. 20 (5), 571-580 (2019).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Misharin, A. V., et al. Monocyte-derived alveolar macrophages drive lung fibrosis and persist in the lung over the life span. Journal of Experimental Medicine. 214 (8), 2387-2404 (2017).
- Koch, C. M., Chiu, S. F., Misharin, A. V., Ridge, K. M. Lung Interstitial Macrophages: Establishing Identity and Uncovering Heterogeneity. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 7-9 (2017).
