Analisi citometrica a flusso per l'identificazione delle cellule immunitarie innate e adattative del polmone murino

Summary

In questo studio, presentiamo un protocollo efficace e riproducibile per isolare le popolazioni immunitarie del sistema respiratorio murino. Forniamo anche un metodo per l’identificazione di tutte le cellule immunitarie innate e adattative che risiedono nei polmoni di topi sani, utilizzando un pannello di citometria a flusso a 9 colori.

Abstract

Il tratto respiratorio è in contatto diretto con l’ambiente esterno e richiede un sistema immunitario regolato con precisione per fornire protezione sopprimendo le reazioni indesiderate agli antigeni ambientali. I polmoni ospitano diverse popolazioni di cellule immunitarie innate e adattative che forniscono sorveglianza immunitaria ma mediano anche le risposte immunitarie protettive. Queste cellule, che mantengono in equilibrio il sistema immunitario polmonare sano, partecipano anche a diverse condizioni patologiche come asma, infezioni, malattie autoimmuni e cancro. L’espressione selettiva delle proteine di superficie e intracellulari fornisce proprietà immunofenotipiche uniche alle cellule immunitarie del polmone. Di conseguenza, la citometria a flusso ha un ruolo strumentale nell’identificazione di tali popolazioni cellulari durante lo stato stazionario e le condizioni patologiche. Questo documento presenta un protocollo che descrive un metodo coerente e riproducibile per identificare le cellule immunitarie che risiedono nei polmoni di topi sani in condizioni di stato stazionario. Tuttavia, questo protocollo può anche essere utilizzato per identificare i cambiamenti in queste popolazioni cellulari in vari modelli di malattia per aiutare a identificare i cambiamenti specifici della malattia nel panorama immunitario polmonare.

Introduction

Il tratto respiratorio murino contiene un sistema immunitario unico responsabile della lotta contro gli agenti patogeni e del mantenimento dell’omeostasi immunitaria. Il sistema immunitario polmonare è costituito da popolazioni cellulari con significativa eterogeneità nel loro fenotipo, funzione, origine e posizione. I macrofagi alveolari residenti (AM), originati principalmente da monociti fetali, risiedono nel lume alveolare1, mentre i macrofagi interstiziali derivati dal midollo osseo (IM) risiedono nel parenchima ^polmonare2. I MESSAGGI possono essere ulteriormente sottoclassificati dall’espressione di CD206. I DM CD206⁺ popolano l’area peribronchiale e perivascolare, mentre i DM CD206^– si trovano all’interstizio alveolare3. Recentemente sono state proposte alcune sottoclassificazioni di IM3,4,5,6. Sebbene gli IM siano meno studiati degli AM, prove recenti supportano il loro ruolo cruciale nella regolazione del sistema immunitario del ^polmone7. Inoltre, CD206 è espresso anche in ^AM8 attivati alternativamente.

Le cellule dendritiche polmonari (DC) sono un altro gruppo eterogeneo di cellule immunitarie polmonari per quanto riguarda le loro proprietà funzionali, posizione e origine. Quattro sottocategorie di DC sono state descritte nel polmone: DC CD103⁺ convenzionali (note anche come cDC1), DC CD11b⁺ convenzionali (note anche come cDC2), DC derivate da monociti (MoDC) e DC plasmacitoidi9,10,11,12,13. Le prime tre sottoclassi possono essere definite come complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. I DC plasmacitoidi esprimono MHC II e sono intermediamente positivi per CD11c ma esprimono alti livelli di B220 e PDCA-19,13,16. Nei polmoni murini naïve, le DC CD103 e le DC CD11b si trovano nell’interstizio delle vie aeree, mentre le DC plasmacitoidi si trovano nell’interstizio ^alveolare17.

Due principali popolazioni di monociti risiedono nel polmone durante lo stato stazionario: monociti classici e monociti non classici. I monociti classici sono Ly6C⁺ e sono fondamentali per la risposta infiammatoria iniziale. Al contrario, i monociti non classici sono Ly6C^– e sono stati ampiamente visti come cellule antinfiammatorie3,16,18. Recentemente, è stata descritta un’ulteriore popolazione ^{di monociti} CD64⁺CD16.2+, che provengono da monociti Ly6C^– e danno origine a CD206^{+ IM3}.

Gli eosinofili compaiono principalmente nei polmoni durante l’infezione da elminti o condizioni allergiche. Tuttavia, c’è un piccolo numero di eosinofili nel parenchima polmonare durante lo stato stazionario, noto come eosinofili residenti. In contrasto con gli eosinofili residenti, gli eosinofili infiammatori si trovano nell’interstizio polmonare e nel lavaggio broncoalveolare (BAL). Nei modelli murini di acaro della polvere domestica (HDM), gli eosinofili infiammatori vengono reclutati nel polmone dopo la stimolazione mediata dall’antigene. È stato proposto che gli eosinofili residenti potrebbero avere un ruolo regolatore nell’allergia inibendo la sensibilizzazione T helper 2 (Th2) a ^HDM19.

A differenza del resto delle cellule mieloidi polmonari, i neutrofili esprimono Ly6G ma non CD68 e sono caratterizzati da una firma dell’immunofenotipo CD68-Ly6G⁺16,20,21. Studi di visualizzazione hanno dimostrato che durante lo stato stazionario, il polmone riserva un pool di neutrofili nel compartimento intravascolare e ospita un numero considerevole di neutrofili ^{extravascolari22}. Simile agli eosinofili, i neutrofili non si trovano in BAL allo stato stazionario; tuttavia, diverse forme di stimolazione immunitaria, come la sfida LPS, l’asma o la polmonite, spingono i neutrofili nel lume alveolare, con conseguente presenza in BAL21,22,23.

Un numero considerevole di cellule CD45⁺ del polmone rappresentano cellule natural killer (NK), T e B e sono negative per la maggior parte dei marcatori mieloidi24. Nei polmoni di topi naïve, questi tre tipi di cellule possono essere identificati in base all’espressione di CD11b e MHC ^II18. Circa il 25% delle cellule CD45⁺ polmonari sono cellule B, mentre la percentuale di cellule NK è più alta nel polmone rispetto ad altri tessuti linfoidi e non linfoidi24,25,26. Tra le cellule T polmonari, una frazione considerevole è ^CD4-CD8– e svolge un ruolo importante nelle infezioni ^{respiratorie26}.

Poiché il polmone ospita un sistema immunitario molto complesso e unico, sono state sviluppate e riportate diverse strategie di gating per l’identificazione delle cellule immunitarie polmonari16,18,20,27. La strategia di gating qui descritta fornisce un modo completo e riproducibile per identificare fino a 12 diverse popolazioni immunitarie mieloidi polmonari e non mieloidi utilizzando 9 marcatori. Ulteriori marcatori sono stati utilizzati per convalidare i risultati. Inoltre, viene fornito un metodo dettagliato per la preparazione di una sospensione unicellulare che minimizza la morte cellulare e consente l’identificazione del profilo più completo del compartimento cellulare immunitario del polmone. Va notato che l’identificazione delle cellule non immunitarie del polmone, come le cellule epiteliali (CD45-CD326⁺CD31^–), le cellule endoteliali (CD45-CD326-CD31⁺) e i fibroblasti richiede un approccio ^diverso28,29. L’identificazione di tali popolazioni non è inclusa nel protocollo e nel metodo qui descritti.

Protocol

Tutti gli studi e gli esperimenti descritti in questo protocollo sono stati condotti secondo le linee guida secondo l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Beth Israel Deaconess Medical Center. Sei a dieci settimane di topi C57BL / 6 di entrambi i sessi sono stati utilizzati per sviluppare questo protocollo. 1. Escissione chirurgica e preparazione dei tessuti Eutanasia del topo iniettando per via intraperitoneale 1 mL di tribromoetanolo (preparato secondo il protoco…

Representative Results

Strategia di GatingIl primo passo della nostra strategia di gating è l’esclusione dei detriti e dei doppietti (Figura 1A). Un’attenta esclusione dei doppietti è fondamentale per evitare popolazioni di falsi positivi (Figura supplementare S2). Quindi, le cellule immunitarie vengono identificate utilizzando CD45+, un marcatore per le cellule ematopoietiche (Figura 1B). La macchia morta può essere aggiunta per esc…

Discussion

L’identificazione delle cellule immunitarie polmonari può essere difficile a causa dei molteplici tipi di cellule immunitarie che risiedono nel polmone e delle loro caratteristiche immunofenotipiche uniche rispetto alle loro controparti che risiedono in altri tessuti. In diverse condizioni patologiche, le cellule con caratteristiche fenotipiche distinte appaiono nei polmoni. Ad esempio, la lesione polmonare indotta dalla bleomicina provoca il reclutamento di macrofagi derivati da monociti circolanti nello spazio alveola…

Materials

10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co