I denne studien presenterer vi en effektiv og reproduserbar protokoll for å isolere immunpopulasjonene i murin respiratorisk system. Vi tilbyr også en metode for identifisering av alle medfødte og adaptive immunceller som ligger i lungene til friske mus, ved hjelp av et 9-fargebasert strømningscytometripanel.
Luftveiene er i direkte kontakt med utemiljøet og krever et nøyaktig regulert immunsystem for å gi beskyttelse samtidig som uønskede reaksjoner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vert for flere populasjoner av medfødte og adaptive immunceller som gir immunovervåking, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse cellene, som holder det sunne lunge immunforsvaret i balanse, deltar også i flere patologiske forhold som astma, infeksjoner, autoimmune sykdommer og kreft. Selektivt uttrykk for overflate og intracellulære proteiner gir unike immunofenotypiske egenskaper til immuncellene i lungen. Derfor har strømningscytometri en viktig rolle i identifiseringen av slike cellepopulasjoner under steady-state og patologiske forhold. Dette dokumentet presenterer en protokoll som beskriver en konsekvent og reproduserbar metode for å identifisere immuncellene som ligger i lungene til friske mus under steady-state forhold. Denne protokollen kan imidlertid også brukes til å identifisere endringer i disse cellepopulasjonene i ulike sykdomsmodeller for å bidra til å identifisere sykdomsspesifikke endringer i lungeimmunelandskapet.
Murin luftveiene inneholder et unikt immunsystem som er ansvarlig for å bekjempe patogener og opprettholde immun homeostase. Lungeimmunsystemet består av cellulære populasjoner med betydelig heterogenitet i fenotype, funksjon, opprinnelse og plassering. Resident alveolar makrofager (AMs), stammer hovedsakelig fra fostermonocytter, bor i alveolar lumen1, mens benmargsavledede interstitielle makrofager (IMs) bor i lungeparenchyma2. Direktemeldinger kan underklassifiseres ytterligere av uttrykket for CD206. CD206+ IMs fyller peribronchial og perivascular området, mens CD206– IMs er plassert på alveolar interstitium3. Noen få underklassifiseringer av direktemeldinger er foreslått nylig3,4,5,6. Selv om IMs er mindre studert enn AMs, støtter nyere bevis deres avgjørende rolle i reguleringen av immunsystemet i lungen7. I tillegg uttrykkes CD206 også i alternativt aktiverte AMs8.
Lunge dendritiske celler (DCs) er en annen heterogen gruppe lunge immunceller med hensyn til deres funksjonelle egenskaper, plassering og opprinnelse. Fire underkategorier av domenekontrollere er beskrevet i lungene: konvensjonelle CD103+ domenekontrollere (også kjent som cDC1), konvensjonelle CD11b+ domenekontrollere (også kjent som cDC2), monocytt-avledede domenekontrollere (MoDC) og plasmacytoid-domenekontrollere9,10,11,12,13. De tre første underklassene kan defineres som hovedkomplekset for histokompatibilitet (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Plasmacytoid DCs uttrykker MHC II og er mellomliggende positive for CD11c, men uttrykker høye nivåer av B220 og PDCA-19,13,16. I naive murin lunger er CD103 DCs og CD11b DCs plassert i luftveiene interstitium, mens plasmacytoid DCs ligger i alveolar interstitium17.
To store populasjoner av monocytter bor i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C + og er kritiske for den første inflammatoriske responsen. Derimot er ikke-klassiske monocytter Ly6C– og har blitt sett på som antiinflammatoriske celler3,16,18. Nylig ble en ekstra populasjon av CD64 + CD16.2 + monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C– monocytter og gir opphav til CD206 + IMs3.
Eosinofiler forekommer hovedsakelig i lungene under helminthinfeksjon eller allergiske forhold. Imidlertid er det et lite antall eosinofiler i lungeparenchyma under steady state, kjent som bosatt eosinofiler. I motsetning til de bosatte eosinofiler finnes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronkoalveolar lavage (BAL). I musemodeller av husstøvmitt (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungene etter antigenmediert stimulering. Det er foreslått at bosatte eosinofiler kan ha en regulatorisk rolle i allergi ved å hemme T-hjelper 2 (Th2) sensibilisering til HDM19.
I motsetning til resten av lunge myeloidceller uttrykker nøytrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er preget av en signatur av CD68-Ly6G + immunofenotype16,20,21. Visualiseringsstudier har vist at lungene under steady state reserverer et basseng med nøytrofiler i det intravaskulære rommet og er vert for et betydelig antall ekstravaskulære nøytrofiler22. I likhet med eosinofiler finnes ikke nøytrofiler i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, som LPS-utfordring, astma eller lungebetennelse, nøytrofiler inn i alveolar lumen, noe som resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.
Et betydelig antall CD45+ celler i lungen representerer naturlig morder (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloidmarkører24. I lungene til naive mus kan disse tre celletypene identifiseres basert på uttrykket av CD11b og MHC II18. Rundt 25% av lunge-CD45+ celler er B-celler, mens prosentandelen NK-celler er høyere i lungen enn andre lymfoide og ikke-lymfoide vev24,25,26. Blant lunge T-celler er en betydelig brøkdel CD4-CD8– og spiller en viktig rolle i luftveisinfeksjoner26.
Fordi lungen er vert for et svært komplekst og unikt immunsystem, har flere gating strategier for identifisering av lungeimmunceller blitt utviklet og rapportert16,18,20,27. Gating strategien beskrevet heri gir en omfattende og reproduserbar måte å identifisere opptil 12 forskjellige lunge myeloid og ikke-myeloid immunpopulasjoner ved hjelp av 9 markører. Flere indikatorer er brukt til å validere resultatene. Videre er det gitt en detaljert metode for fremstilling av en encellet suspensjon som minimerer celledød og tillater identifisering av den mest komplette profilen til immuncellerommet i lungen. Det skal bemerkes at identifisering av ikke-immunceller i lungen, for eksempel epitelceller (CD45-CD326 +CD31–), endotelceller (CD45-CD326-CD31+), og fibroblaster krever en annen tilnærming28,29. Identifisering av slike populasjoner er ikke inkludert i protokollen og metoden som er beskrevet her.
Identifisering av lungeimmuneceller kan være utfordrende på grunn av de mange immuncelletypene som bor i lungen og deres unike immunofenotypiske egenskaper sammenlignet med deres kolleger som bor i andre vev. Under flere patologiske forhold vises celler med tydelige fenotypiske egenskaper i lungene. For eksempel resulterer bleomycinindusert lungeskade i rekrutteringen av sirkulerende monocytt-avledede makrofager i alveolarrommet, hvor de kan forbli så lenge som ett år og til og med vedvare etter bleomycinindusert fib…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH-tilskudd R01CA238263 og R01CA229784 (VAB).
10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
Centrifuge | |||
Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
Ethanol | |||
F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
Petri dish | Falcon | 351029 | |
Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |