Flow cytometrisk analyse for identifisering av de medfødte og adaptive immuncellene i Murine Lung

Summary

I denne studien presenterer vi en effektiv og reproduserbar protokoll for å isolere immunpopulasjonene i murin respiratorisk system. Vi tilbyr også en metode for identifisering av alle medfødte og adaptive immunceller som ligger i lungene til friske mus, ved hjelp av et 9-fargebasert strømningscytometripanel.

Abstract

Luftveiene er i direkte kontakt med utemiljøet og krever et nøyaktig regulert immunsystem for å gi beskyttelse samtidig som uønskede reaksjoner på miljøantigener undertrykkes. Lunger er vert for flere populasjoner av medfødte og adaptive immunceller som gir immunovervåking, men også formidler beskyttende immunresponser. Disse cellene, som holder det sunne lunge immunforsvaret i balanse, deltar også i flere patologiske forhold som astma, infeksjoner, autoimmune sykdommer og kreft. Selektivt uttrykk for overflate og intracellulære proteiner gir unike immunofenotypiske egenskaper til immuncellene i lungen. Derfor har strømningscytometri en viktig rolle i identifiseringen av slike cellepopulasjoner under steady-state og patologiske forhold. Dette dokumentet presenterer en protokoll som beskriver en konsekvent og reproduserbar metode for å identifisere immuncellene som ligger i lungene til friske mus under steady-state forhold. Denne protokollen kan imidlertid også brukes til å identifisere endringer i disse cellepopulasjonene i ulike sykdomsmodeller for å bidra til å identifisere sykdomsspesifikke endringer i lungeimmunelandskapet.

Introduction

Murin luftveiene inneholder et unikt immunsystem som er ansvarlig for å bekjempe patogener og opprettholde immun homeostase. Lungeimmunsystemet består av cellulære populasjoner med betydelig heterogenitet i fenotype, funksjon, opprinnelse og plassering. Resident alveolar makrofager (AMs), stammer hovedsakelig fra fostermonocytter, bor i alveolar ^lumen1, mens benmargsavledede interstitielle makrofager (IMs) bor i lungeparenchyma2. Direktemeldinger kan underklassifiseres ytterligere av uttrykket for CD206. CD206⁺ IMs fyller peribronchial og perivascular området, mens CD206^– IMs er plassert på alveolar interstitium3. Noen få underklassifiseringer av direktemeldinger er foreslått nylig3,4,5,6. Selv om IMs er mindre studert enn AMs, støtter nyere bevis deres avgjørende rolle i reguleringen av immunsystemet i ^lungen7. I tillegg uttrykkes CD206 også i alternativt aktiverte ^AMs8.

Lunge dendritiske celler (DCs) er en annen heterogen gruppe lunge immunceller med hensyn til deres funksjonelle egenskaper, plassering og opprinnelse. Fire underkategorier av domenekontrollere er beskrevet i lungene: konvensjonelle CD103⁺ domenekontrollere (også kjent som cDC1), konvensjonelle CD11b⁺ domenekontrollere (også kjent som cDC2), monocytt-avledede domenekontrollere (MoDC) og plasmacytoid-domenekontrollere9,10,11,12,13. De tre første underklassene kan defineres som hovedkomplekset for histokompatibilitet (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Plasmacytoid DCs uttrykker MHC II og er mellomliggende positive for CD11c, men uttrykker høye nivåer av B220 og PDCA-19,13,16. I naive murin lunger er CD103 DCs og CD11b DCs plassert i luftveiene interstitium, mens plasmacytoid DCs ligger i alveolar ^{interstitium17}.

To store populasjoner av monocytter bor i lungen under steady state: klassiske monocytter og ikke-klassiske monocytter. Klassiske monocytter er Ly6C ⁺ og er kritiske for den første inflammatoriske responsen. Derimot er ikke-klassiske monocytter Ly6C^– og har blitt sett på som antiinflammatoriske celler3,16,18. Nylig ble en ekstra populasjon av CD64 ⁺ CD16.2 ⁺ monocytter beskrevet, som stammer fra Ly6C^– monocytter og gir opphav til CD206 ^{+ IMs3}.

Eosinofiler forekommer hovedsakelig i lungene under helminthinfeksjon eller allergiske forhold. Imidlertid er det et lite antall eosinofiler i lungeparenchyma under steady state, kjent som bosatt eosinofiler. I motsetning til de bosatte eosinofiler finnes inflammatoriske eosinofiler i lungeinterstitium og bronkoalveolar lavage (BAL). I musemodeller av husstøvmitt (HDM) rekrutteres inflammatoriske eosinofiler i lungene etter antigenmediert stimulering. Det er foreslått at bosatte eosinofiler kan ha en regulatorisk rolle i allergi ved å hemme T-hjelper 2 (Th2) sensibilisering til ^HDM19.

I motsetning til resten av lunge myeloidceller uttrykker nøytrofiler Ly6G, men ikke CD68 og er preget av en signatur av CD68-Ly6G ⁺ immunofenotype16,20,21. Visualiseringsstudier har vist at lungene under steady state reserverer et basseng med nøytrofiler i det intravaskulære rommet og er vert for et betydelig antall ekstravaskulære ^{nøytrofiler22}. I likhet med eosinofiler finnes ikke nøytrofiler i BAL ved steady state; Imidlertid driver flere former for immunstimulering, som LPS-utfordring, astma eller lungebetennelse, nøytrofiler inn i alveolar lumen, noe som resulterer i deres tilstedeværelse i BAL21,22,23.

Et betydelig antall CD45⁺ celler i lungen representerer naturlig morder (NK), T-celler og B-celler og er negative for de fleste myeloidmarkører24. I lungene til naive mus kan disse tre celletypene identifiseres basert på uttrykket av CD11b og MHC ^II18. Rundt 25% av lunge-CD45⁺ celler er B-celler, mens prosentandelen NK-celler er høyere i lungen enn andre lymfoide og ikke-lymfoide vev24,25,26. Blant lunge T-celler er en betydelig brøkdel ^CD4-CD8– og spiller en viktig rolle i luftveisinfeksjoner26.

Fordi lungen er vert for et svært komplekst og unikt immunsystem, har flere gating strategier for identifisering av lungeimmunceller blitt utviklet og rapportert16,18,20,27. Gating strategien beskrevet heri gir en omfattende og reproduserbar måte å identifisere opptil 12 forskjellige lunge myeloid og ikke-myeloid immunpopulasjoner ved hjelp av 9 markører. Flere indikatorer er brukt til å validere resultatene. Videre er det gitt en detaljert metode for fremstilling av en encellet suspensjon som minimerer celledød og tillater identifisering av den mest komplette profilen til immuncellerommet i lungen. Det skal bemerkes at identifisering av ikke-immunceller i lungen, for eksempel epitelceller (CD45-CD326 ⁺CD31^–), endotelceller (CD45-CD326-CD31⁺), og fibroblaster krever en annen ^{tilnærming28,29}. Identifisering av slike populasjoner er ikke inkludert i protokollen og metoden som er beskrevet her.

Protocol

Alle studier og eksperimenter beskrevet i denne protokollen ble utført under retningslinjer i henhold til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Beth Israel Deaconess Medical Center. Seks til ti uker gamle C57BL/6 mus av begge kjønn ble brukt til å utvikle denne protokollen. 1. Kirurgisk eksisjon og vevsforberedelse Avlive musen ved intraperitoneally injisere 1 ml tribromoetanol (utarbeidet i henhold til standardprotokoll; Tabell over materialer)….

Representative Results

Gating strategiDet første trinnet i vår gating strategi er utelukkelse av rusk og doublets (Figur 1A). Forsiktig utelukkelse av dobler er avgjørende for å unngå falske positive populasjoner (Supplerende figur S2). Deretter identifiseres immunceller ved hjelp av CD45+, en markør for hematopoietiske celler (figur 1B). Den levende døde flekken kan legges til for å utelukke døde celler. Denne protokollen resu…

Discussion

Identifisering av lungeimmuneceller kan være utfordrende på grunn av de mange immuncelletypene som bor i lungen og deres unike immunofenotypiske egenskaper sammenlignet med deres kolleger som bor i andre vev. Under flere patologiske forhold vises celler med tydelige fenotypiske egenskaper i lungene. For eksempel resulterer bleomycinindusert lungeskade i rekrutteringen av sirkulerende monocytt-avledede makrofager i alveolarrommet, hvor de kan forbli så lenge som ett år og til og med vedvare etter bleomycinindusert fib…

Materials

10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co