Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino
Summary
En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.
Abstract
El tracto respiratorio está en contacto directo con el entorno exterior y requiere un sistema inmunológico regulado con precisión para proporcionar protección al tiempo que suprime las reacciones no deseadas a los antígenos ambientales. Los pulmones albergan varias poblaciones de células inmunes innatas y adaptativas que proporcionan vigilancia inmune, pero también median respuestas inmunes protectoras. Estas células, que mantienen el sistema inmunológico pulmonar sano en equilibrio, también participan en varias condiciones patológicas como el asma, infecciones, enfermedades autoinmunes y cáncer. La expresión selectiva de proteínas de superficie e intracelulares proporciona propiedades inmunofenotípicas únicas a las células inmunes del pulmón. En consecuencia, la citometría de flujo tiene un papel instrumental en la identificación de tales poblaciones celulares durante el estado estacionario y las condiciones patológicas. Este artículo presenta un protocolo que describe un método consistente y reproducible para identificar las células inmunes que residen en los pulmones de ratones sanos en condiciones de estado estacionario. Sin embargo, este protocolo también se puede utilizar para identificar cambios en estas poblaciones celulares en varios modelos de enfermedad para ayudar a identificar cambios específicos de la enfermedad en el panorama inmunológico pulmonar.
Introduction
El tracto respiratorio murino contiene un sistema inmunológico único responsable de combatir los patógenos y mantener la homeostasis inmune. El sistema inmune pulmonar consiste en poblaciones celulares con heterogeneidad significativa en su fenotipo, función, origen y ubicación. Los macrófagos alveolares residentes (AM), originados principalmente a partir de monocitos fetales, residen en la luz alveolar1, mientras que los macrófagos intersticiales (IM) derivados de la médula ósea residen en el parénquima pulmonar2. Los mensajes instantáneos se pueden subclasificar aún más mediante la expresión de CD206. Los IM CD206+ pueblan el área peribronquial y perivascular, mientras que los IM CD206– se encuentran en el intersticio alveolar3. Recientemente se han propuesto algunas subclasificaciones de IM3,4,5,6. Aunque los IM están menos estudiados que los AM, la evidencia reciente apoya su papel crucial en la regulación del sistema inmune del pulmón7. Además, CD206 también se expresa en AMs8 activado alternativamente.
Las células dendríticas pulmonares (CD) son otro grupo heterogéneo de células inmunes pulmonares con respecto a sus propiedades funcionales, ubicación y origen. Se han descrito cuatro subcategorías de DC en el pulmón: DC CD103+ convencionales (también conocidos como cDC1), CD CD11b+ convencionales (también conocidos como cDC2), DC derivados de monocitos (MoDC) y DC plasmocitoides9,10,11,12,13. Las tres primeras subclases se pueden definir como complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II+CD11c+9,10,14,15. Los DC plasmocitoides expresan MHC II y son intermediamente positivos para CD11c, pero expresan altos niveles de B220 y PDCA-19,13,16. En los pulmones murinos naïve, los CD CD103 y cd11b se localizan en el intersticio de las vías respiratorias, mientras que los CD plasmocitoides se localizan en el intersticio alveolar17.
Dos poblaciones principales de monocitos residen en el pulmón durante el estado estacionario: monocitos clásicos y monocitos no clásicos. Los monocitos clásicos son Ly6C+ y son críticos para la respuesta inflamatoria inicial. Por el contrario, los monocitos no clásicos son Ly6C– y han sido ampliamente vistos como células antiinflamatorias3,16,18. Recientemente, se describió una población adicional de monocitos CD64+CD16.2+, que se originan a partir de monocitos Ly6C– y dan lugar a IM CD206+3.
Los eosinófilos aparecen principalmente en los pulmones durante la infección por helmintos o afecciones alérgicas. Sin embargo, hay un pequeño número de eosinófilos en el parénquima pulmonar durante el estado estacionario, conocidos como eosinófilos residentes. A diferencia de los eosinófilos residentes, los eosinófilos inflamatorios se encuentran en el intersticio pulmonar y el lavado broncoalveolar (BAL). En modelos de ratón de ácaros del polvo doméstico (HDM), los eosinófilos inflamatorios se reclutan en el pulmón después de la estimulación mediada por antígenos. Se ha propuesto que los eosinófilos residentes podrían tener un papel regulador en la alergia al inhibir la sensibilización del T helper 2 (Th2) a HDM19.
A diferencia del resto de células mieloides pulmonares, los neutrófilos expresan Ly6G pero no CD68 y se caracterizan por una firma del inmunofenotipo CD68-Ly6G+16,20,21. Los estudios de visualización han demostrado que durante el estado estacionario, el pulmón reserva un grupo de neutrófilos en el compartimento intravascular y alberga un número considerable de neutrófilos extravasculares22. Al igual que los eosinófilos, los neutrófilos no se encuentran en BAL en estado estacionario; sin embargo, varias formas de estimulación inmune, como el desafío LPS, el asma o la neumonía, conducen a los neutrófilos a la luz alveolar, lo que resulta en su presencia en BAL21,22,23.
Un número sustancial de células CD45+ del pulmón representan un asesino natural (NK), células T y células B y son negativas para la mayoría de los marcadores mieloides24. En los pulmones de ratones ingenuos, estos tres tipos de células se pueden identificar en función de la expresión de CD11b y MHC II18. Alrededor del 25% de las células CD45+ pulmonares son células B, mientras que el porcentaje de células NK es mayor en el pulmón que en otros tejidos linfoides y no linfoides24,25,26. Entre las células T pulmonares, una fracción considerable es CD4-CD8– y juega un papel importante en las infecciones respiratorias26.
Debido a que el pulmón alberga un sistema inmune muy complejo y único, se han desarrollado y reportado varias estrategias de cierre para la identificación de células inmunes pulmonares16,18,20,27. La estrategia de cierre descrita en este documento proporciona una forma integral y reproducible de identificar hasta 12 poblaciones diferentes de inmunitarias mieloides pulmonares y no mieloides utilizando 9 marcadores. Se han utilizado marcadores adicionales para validar los resultados. Además, se proporciona un método detallado para la preparación de una suspensión unicelular que minimiza la muerte celular y permite la identificación del perfil más completo del compartimiento de células inmunes del pulmón. Cabe destacar que la identificación de células no inmunes del pulmón, como las células epiteliales (CD45-CD326+CD31–), las células endoteliales (CD45-CD326-CD31+) y los fibroblastos requiere un abordaje diferente28,29. La identificación de tales poblaciones no está incluida en el protocolo y método descritos aquí.
Protocol
Representative Results
Discussion
La identificación de las células inmunes pulmonares puede ser un desafío debido a los múltiples tipos de células inmunes que residen en el pulmón y sus características inmunofenotípicas únicas en comparación con sus contrapartes que residen en otros tejidos. En varias condiciones patológicas, las células con características fenotípicas distintas aparecen en los pulmones. Por ejemplo, la lesión pulmonar inducida por bleomicina resulta en el reclutamiento de macrófagos circulantes derivados de monocitos en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los NIH R01CA238263 y R01CA229784 (VAB).
Materials
| 10 mL syringe plunger | EXELINT | 26265 | |
| 18 G needles | BD Precision Glide Needle | 305165 | |
| 21 G needles | BD Precision Glide Needle | 305195 | |
| 50 mL conical tubes | Falcon | 3520 | |
| 70 μm cell strainer | ThermoFisher | 22363548 | |
| 96-well plates | Falcon/corning | 3799 | |
| ACK Lysing Buffer | ThermoFisher | A10492-01 | |
| anti-mouse CD11b | Biolegend | 101215 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD11c | Biolegend | 117339 / 117337 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD45 | Biolegend | 103115 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD64 | Biolegend | 139319 | For details see Table 2 |
| anti-mouse CD68 | Biolegend | 137009 | For details see Table 2 |
| anti-mouse GR-1 | Biolegend | 108433 | For details see Table 2 |
| anti-mouse Siglec F | Biolegend | 155503 | For details see Table 2 |
| AVERTIN | Sigma-Aldrich | 240486 | |
| B220 | Biolegend | 103228 | For details see Table 2 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | |
| CD103 | Biolegend | 121405 / 121419 | For details see Table 2 |
| CD24 | Biolegend | 138503 | For details see Table 2 |
| CD3 | Biolegend | 100205 | For details see Table 2 |
| Centrifuge | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| CX3CR1 | Biolegend | 149005 | For details see Table 2 |
| DNase I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ethanol | |||
| F4/80 | Biolegend | 123133 | For details see Table 2 |
| FcBlock (CD16/32) | Biolegend | 101301 | For details see Table 2 |
| Fetal Bovine Serum | R&D Systems | ||
| Fine Serrated Forceps | Roboz Surgical Instrument Co | ||
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | |
| Futura Safety Scalpel | Merit Medical Systems | SMS210 | |
| Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher | L34973 | For details see Table 2 |
| MERTK | Biolegend | 151505 | For details see Table 2 |
| MHC-II | Biolegend | 107621 | For details see Table 2 |
| NK1.1 | Biolegend | 108705 | For details see Table 2 |
| Orbital Shaker | VWR | Model 200 | |
| Petri dish | Falcon | 351029 | |
| Refrigerated benchtop centrifuge | SORVAL ST 16R | ||
| Small curved scissor | Roboz Surgical Instrument Co |
References
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