Flödescytometrisk analys för identifiering av de medfödda och adaptiva immuncellerna i Murine Lung

Summary

I denna studie presenterar vi ett effektivt och reproducerbart protokoll för att isolera immunpopulationerna i murin andningsorganen. Vi tillhandahåller också en metod för identifiering av alla medfödda och adaptiva immunceller som finns i lungorna hos friska möss, med hjälp av en 9-färgbaserad flödescytometripanel.

Abstract

Luftvägarna är i direkt kontakt med omvärlden och kräver ett exakt reglerat immunsystem för att ge skydd samtidigt som oönskade reaktioner på miljöantigener undertrycks. Lungor är värd för flera populationer av medfödda och adaptiva immunceller som ger immunövervakning men också förmedlar skyddande immunsvar. Dessa celler, som håller det friska lungimmunsystemet i balans, deltar också i flera patologiska tillstånd som astma, infektioner, autoimmuna sjukdomar och cancer. Selektivt uttryck av ytan och intracellulära proteiner ger unika immunophenotypic egenskaper till immuncellerna i lungan. Följaktligen har flöde cytometri en avgörande roll i identifieringen av sådana cellpopulationer under steady-state och patologiska villkor. Detta dokument presenterar ett protokoll som beskriver en konsekvent och reproducerbar metod för att identifiera immunceller som finns i lungorna hos friska möss under steady-state förhållanden. Detta protokoll kan dock också användas för att identifiera förändringar i dessa cellpopulationer i olika sjukdomsmodeller för att identifiera sjukdomsspecifika förändringar i lungens immunlandskap.

Introduction

Murin luftvägarna innehåller ett unikt immunsystem som ansvarar för att bekämpa patogener och upprätthålla immun homeostas. Lungimmunsystemet består av cellulära populationer med betydande heterogenitet i deras fenotyp, funktion, ursprung och plats. Resident alveolar makrofager (AMs), härrör främst från fetala monocyter, bor i alveolar ^lumen1, medan benmärg-härledda interstitial makrofager (IMs) bor i lung parenchyma2. IM kan ytterligare underklassificeras genom uttrycket av CD206. CD206⁺ IMs fyller peribronchial- och perivascular-området, medan CD206-IMs finns vid alveolar interstitium3. Några underklassificeringar av IM har föreslagits nyligen3,4,5,6. Även om IM är mindre studerade än AMs, stöder nya bevis deras avgörande roll i regleringen av immunsystemet i ^lung7. Dessutom uttrycks CD206 också i alternativt aktiverade ^AMs8.

Lung dendritiska celler (DCs) är en annan heterogen grupp av lung immunceller med avseende på deras funktionella egenskaper, plats och ursprung. Fyra underkategorier av DCs har beskrivits i lungan: konventionella CD103 ⁺ DCs (även känd som cDC1), konventionella CD11b ⁺ DCs (även känd som cDC2), monocyt-härledda DCs (MoDC) och plasmacytoid DCs9,10,11,12,13. De tre första underklasserna kan definieras som större histokompatibilitetskomplex (MHC) II⁺CD11c⁺9,10,14,15. Plasmacytoid DCs uttrycker MHC II och är mellanliggande positiva för CD11c men uttrycker höga nivåer av B220 och PDCA-19,13,16. I naiva murin lungor, CD103 DCs och CD11b DCs finns i luftvägarna interstitium, medan plasmacytoid DCs finns i alveolar ^{interstitium17}.

Två stora populationer av monocyter bor i lungan under steady state: klassiska monocyter och icke-klassiska monocyter. Klassiska monocyter är Ly6C⁺ och är kritiska för det första inflammatoriska svaret. Däremot är icke-klassiska monocyter Ly6C^– och har allmänt setts som antiinflammatoriska celler3,16,18. Nyligen beskrevs en ytterligare population av CD64 ⁺ CD16.2 ⁺ monocyter, som härstammar från Ly6C^– monocyter och ger upphov till CD206 ^{+ IMs3}.

Eosinofiler förekommer främst i lungorna under helminthinfektion eller allergiska tillstånd. Det finns dock ett litet antal eosinofiler i lungparenkym under steady state, känd som bosatta eosinofiler. I motsats till de bosatta eosinofilerna finns inflammatoriska eosinofiler i lunginterstitium och bronchoalveolar lavage (BAL). I musmodeller av husdammmyt (HDM) rekryteras inflammatoriska eosinofiler i lungan efter antigenmedierad stimulering. Det har föreslagits att bosatta eosinofiler kan ha en regulatorisk roll i allergi genom att hämma T helper 2 (Th2) sensibilisering till ^HDM19.

I motsats till resten av lung myeloiska celler uttrycker neutrofiler Ly6G men inte CD68 och kännetecknas av en signatur av CD68-Ly6G ⁺ immunophenotype16,20,21. Visualiseringsstudier har visat att under steady state reserverar lungan en pool av neutrofiler i det intravaskulära utrymmet och är värd för ett stort antal extravaskulära ^{neutrofiler22}. I likhet med eosinofiler finns neutrofiler inte i BAL i stabilt tillstånd; emellertid, flera former av immunstimulering, såsom LPS utmaning, astma eller lunginflammation, driva neutrofiler i alveolar lumen, vilket resulterar i deras närvaro i BAL21,22,23.

Ett betydande antal CD45 ⁺ celler i lungan representerar naturliga mördare (NK), T-celler och B celler och är negativa för de flesta myeloiska ^markörer24. I lungorna hos naiva möss kan dessa tre celltyper identifieras baserat på uttrycket av CD11b och MHC ^II18. Omkring 25% av lung-CD45⁺-cellerna är B-celler, medan andelen NK-celler är högre i lungan än andra lymfoida och icke-lymfoida vävnader24,25,26. Bland lung-T-celler är en betydande fraktion ^CD4-CD8– och spelar en viktig roll vid luftvägsinfektioner26.

Eftersom lungan är värd för ett mycket komplext och unikt immunsystem har flera gating strategier för identifiering av lung immunceller utvecklats och rapporterats16,18,20,27. Gating strategi beskrivs häri ger ett omfattande och reproducerbart sätt att identifiera upp till 12 olika pulmonell myeloiska och icke-myeloiska immunpopulationer med 9 markörer. Ytterligare markörer har använts för att validera resultaten. Dessutom tillhandahålls en detaljerad metod för beredning av en encellssuspension som minimerar celldöd och gör det möjligt att identifiera den mest kompletta profilen av lungens immuncellsfack. Det bör noteras att identifiering av icke-immuna celler i lungan, såsom epitelceller (CD45-CD326⁺CD31^–), endotelceller (CD45-CD326-CD31⁺) och fibroblaster kräver ett annat ^{tillvägagångssätt28,29}. Identifiering av sådana populationer ingår inte i det protokoll och den metod som beskrivs här.

Protocol

Alla studier och experiment som beskrivs i detta protokoll utfördes enligt riktlinjer enligt Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Beth Israel Deaconess Medical Center. Sex till tio veckor gamla C57BL/6 möss av båda könen användes för att utveckla detta protokoll. 1. Kirurgisk excision och vävnadsberedning Avliva musen genom att intraperitoneally injicera 1 ml tribromoetanol (beredd enligt standardprotokoll; Tabell över material).OBS: <s…

Representative Results

Gating-strategiDet första steget i vår gitterstrategi är uteslutandet av skräp och dubbletter (figur 1A). Noggrann uteslutning av dubbletter är avgörande för att undvika falskt positiva populationer (kompletterande figur S2). Sedan identifieras immunceller med HJÄLP AV CD45+, en markör för hematopoetiska celler (figur 1B). Den levande döda fläcken kan läggas till för att utesluta döda celler. Detta …

Discussion

Identifiering av lung immunceller kan vara utmanande på grund av de flera immun celltyper som finns i lungan och deras unika immunophenotypic egenskaper jämfört med deras motsvarigheter som bor i andra vävnader. I flera patologiska förhållanden uppträder celler med distinkta fenotypiska funktioner i lungorna. Till exempel resulterar bleomycin-inducerad lungskada i rekrytering av cirkulerande monocyt-härledda makrofager i alveolar utrymmet, där de kan förbli så länge som ett år och även kvarstå efter bleomy…

Materials

10 mL syringe plunger	EXELINT	26265
18 G needles	BD Precision Glide Needle	305165
21 G needles	BD Precision Glide Needle	305195
50 mL conical tubes	Falcon	3520
70 μm cell strainer	ThermoFisher	22363548
96-well plates	Falcon/corning	3799
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A10492-01
anti-mouse CD11b	Biolegend	101215	For details see Table 2
anti-mouse CD11c	Biolegend	117339 / 117337	For details see Table 2
anti-mouse CD45	Biolegend	103115	For details see Table 2
anti-mouse CD64	Biolegend	139319	For details see Table 2
anti-mouse CD68	Biolegend	137009	For details see Table 2
anti-mouse GR-1	Biolegend	108433	For details see Table 2
anti-mouse Siglec F	Biolegend	155503	For details see Table 2
AVERTIN	Sigma-Aldrich	240486
B220	Biolegend	103228	For details see Table 2
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	9048-46-8
CD103	Biolegend	121405 / 121419	For details see Table 2
CD24	Biolegend	138503	For details see Table 2
CD3	Biolegend	100205	For details see Table 2
Centrifuge
Collagenase Type 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
CX3CR1	Biolegend	149005	For details see Table 2
DNase I	Millipore Sigma	10104159001
Ethanol
F4/80	Biolegend	123133	For details see Table 2
FcBlock (CD16/32)	Biolegend	101301	For details see Table 2
Fetal Bovine Serum	R&D Systems
Fine Serrated Forceps	Roboz Surgical Instrument Co
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set	ThermoFisher	00-5523-00
Futura Safety Scalpel	Merit Medical Systems	SMS210
Live/Dead Fixable Far Read Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34973	For details see Table 2
MERTK	Biolegend	151505	For details see Table 2
MHC-II	Biolegend	107621	For details see Table 2
NK1.1	Biolegend	108705	For details see Table 2
Orbital Shaker	VWR	Model 200
Petri dish	Falcon	351029
Refrigerated benchtop centrifuge	SORVAL ST 16R
Small curved scissor	Roboz Surgical Instrument Co