هنا نصف بروتوكول لتوليد الأجهزة العضوية في الدماغ من الخلايا الجذعية المستحثة من قبل الإنسان (iPSCs). للحصول على أعضاء الدماغ بكميات كبيرة وبجودة عالية، نستخدم المفاعلات الحيوية المصغرة المصنوعة منزليا.
الجهاز العضوي الدماغ المستمدة من iPSC هي تقنية واعدة للنمذجة في المختبر أمراض الجهاز العصبي وفحص المخدرات. وقد ظهرت هذه التكنولوجيا في الآونة الأخيرة. وهي لا تزال في مهدها ولم تحل بعض القيود بعد. البروتوكولات الحالية لا تسمح الحصول على organoids لتكون متسقة بما فيه الكفاية لاكتشاف المخدرات والدراسات قبل السريرية. يمكن أن يستغرق نضوج الأعضاء ما يصل إلى عام ، مما يدفع الباحثين إلى إطلاق عمليات تمايز متعددة في وقت واحد. ويفرض تكاليف إضافية على المختبر من حيث المساحة والمعدات. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يكون لدى أعضاء الدماغ منطقة نخرية في المركز ، والتي تعاني من نقص المغذيات والأوكسجين. ومن ثم، فإن معظم البروتوكولات الحالية تستخدم نظاما متداولا للوسط الثقافي لتحسين التغذية.
وفي الوقت نفسه، لا توجد أنظمة ديناميكية غير مكلفة أو مفاعلات حيوية لزراعة الأعضاء العضوية. تصف هذه الورقة بروتوكولا لإنتاج أعضاء الدماغ في المفاعلات الحيوية الصغيرة المدمجة وغير المكلفة المصنوعة منزليا. يسمح هذا البروتوكول بالحصول على أجهزة عضوية عالية الجودة بكميات كبيرة.
وتستخدم على نطاق واسع نماذج الإنسان iPSC المستمدة في دراسات الاضطرابات العصبية النمائية والعصبية1. على مدى العقد الماضي، نماذج أنسجة الدماغ 3D، ما يسمى organoids الدماغ، تكمل أساسا الثقافات العصبية التقليدية 2D2. الأجهزة العضوية تلخيص إلى حد ما الهندسة المعمارية 3D من الدماغ الجنيني والسماح النمذجة أكثر دقة. يتم نشر العديد من البروتوكولات لجيل من organoids تمثل مناطق الدماغ المختلفة: قشرة الدماغ3,4,5, المخيخ6, منتصف الدماغ, الدماغ الأمامي, تحت المهاد7,8,9, والحصين10. كانت هناك أمثلة متعددة لاستخدام organoids لدراسة أمراض الجهاز العصبي البشري11. أيضا ، تم تنفيذ organoids في الاكتشافات المخدرات12 وتستخدم في دراسات الأمراض المعدية ، بما في ذلك سارس – كوف – 213،14.
يمكن أن تصل عضويات الدماغ إلى عدة ملليمترات في القطر. لذلك ، قد تعاني المنطقة الداخلية من الجهاز من نقص الأكسيجة أو سوء التغذية وتصبح في نهاية المطاف نخرية. لذلك، تتضمن العديد من البروتوكولات المفاعلات الحيوية الخاصة8،الهزازات، أو أنظمة microfluidic15. قد تتطلب هذه الأجهزة كميات كبيرة من الوسائط ثقافة الخلية مكلفة. كما أن تكلفة هذه المعدات عادة ما تكون مرتفعة. تتكون بعض المفاعلات الحيوية من العديد من الأجزاء الميكانيكية التي تجعل من الصعب تعقيمها لإعادة استخدامها.
معظم البروتوكولات تعاني من “تأثير دفعي”16، مما يولد تباينا كبيرا بين organoids التي تم الحصول عليها من iPSCs متطابقة. هذا التباين يعوق اختبار المخدرات أو الدراسات قبل السريرية التي تتطلب التوحيد. الغلة العالية من organoids بما فيه الكفاية لتحديد organoids من حجم موحد قد يحل جزئيا هذه المشكلة.
عامل الوقت هو أيضا مشكلة كبيرة. أظهر ماتسوي وآخرون (2018) أن أعضاء الدماغ تتطلب ستة أشهر على الأقل للوصول إلى مرحلة النضج17. تروخيلو وآخرون (2019) أظهر أيضا أن النشاط الكهربي حدث في الأجهزة العضوية فقط بعد ستة أشهر منالزراعة 18. بسبب فترة النضج العضوي الطويلة ، يطلق الباحثون في كثير من الأحيان تمايزا جديدا قبل إكمال سابقه. تتطلب عمليات التمايز المتوازية المتعددة نفقات ومعدات ومساحات مختبرية إضافية.
لقد قمنا مؤخرا بتطوير مفاعل حيوي مصغر يحل بشكل رئيسي المشاكل المذكورة أعلاه19. يتكون هذا المفاعل الحيوي المصنوع منزليا من التصاق منخفض للغاية أو طبق بيتري غير المعالج مع مقبض بلاستيكي في الوسط. هذا مقبض بلاستيكي يمنع تزاحم organoids وconglutination بهم في وسط طبق بيتري، الذي يسببه تناوب شاكر. تصف هذه الورقة كيف أن هذا المفاعل الحيوي الصغير غير المكلف والبسيط المصنوع منزليا يسمح بتوليد أعضاء دماغية عالية الجودة بكميات كبيرة.
البروتوكول الموصوف له خطوتان حاسمتان تسمحان بتوليده من الأجهزة عالية الجودة ذات الحجم الموحد. أولا ، تنمو الأجهزة العضوية من كرويات متطابقة تقريبا في عدد الخلايا ونضج الخلية. ثانيا، توفر المفاعلات الحيوية المصنوعة منزليا لكل عضو بيئة موحدة، حيث لا تزاحم الأعضاء أو تلتصق ببعضها البعض.
<…The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال المنحة 075-15-2019-1669 من وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي (تحليل RT-PCR) والمنحة رقم 19-15-00425 من مؤسسة العلوم الروسية (لجميع الأعمال الأخرى). كما يشكر المؤلفون بافل بيلكوف على مساعدته في تحرير الفيديو. تم إنشاء الأرقام في المخطوطة مع BioRender.com.
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |