Hier beschrijven we een protocol voor het genereren van hersenorganoïden uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s). Om hersenorganoïden in grote hoeveelheden en van hoge kwaliteit te verkrijgen, gebruiken we zelfgemaakte mini-bioreactoren.
De iPSC-afgeleide hersenorganoïde is een veelbelovende technologie voor het in vitro modelleren van de pathologieën van het zenuwstelsel en het screenen van geneesmiddelen. Deze technologie is onlangs ontstaan. Het staat nog in de kinderschoenen en heeft een aantal beperkingen die nog niet zijn opgelost. De huidige protocollen staan niet toe dat het verkrijgen van organoïden consistent genoeg is voor het ontdekken van geneesmiddelen en preklinische studies. De rijping van organoïden kan tot een jaar duren, waardoor de onderzoekers meerdere differentiatieprocessen tegelijkertijd moeten starten. Het brengt extra kosten met zich mee voor het laboratorium op het gebied van ruimte en apparatuur. Bovendien hebben hersenorganoïden vaak een necrotische zone in het centrum, die lijdt aan voedings- en zuurstoftekort. Vandaar dat de meeste huidige protocollen een circulerend systeem voor kweekmedium gebruiken om de voeding te verbeteren.
Ondertussen zijn er geen goedkope dynamische systemen of bioreactoren voor organoïde teelt. Dit artikel beschrijft een protocol voor het produceren van hersenorganoïden in compacte en goedkope zelfgemaakte mini-bioreactoren. Dit protocol maakt het mogelijk om organoïden van hoge kwaliteit in grote hoeveelheden te verkrijgen.
Menselijke iPSC-afgeleide modellen worden veel gebruikt in de studies van neurologische en neurodegeneratieve aandoeningen1. In het afgelopen decennium hebben 3D-hersenweefselmodellen, zogenaamde hersenorganoïden, in wezen traditionele 2D-neuronale culturenaangevuld 2. De organoïden vatten tot op zekere hoogte de 3D-architectuur van het embryonale brein samen en maken nauwkeurigere modellering mogelijk. Veel protocollen zijn gepubliceerd voor het genereren van organoïden die verschillende hersengebieden vertegenwoordigen: hersenschors3,4,5,cerebellum6,middenhersenen, voorhersenen, hypothalamus7,8,9en hippocampus10. Er zijn meerdere voorbeelden van het gebruik van organoïden om ziekten van het menselijk zenuwstelsel tebestuderen 11. Ook werden de organoïden geïmplementeerd in medicijnontdekkingen12 en gebruikt in studies van infectieziekten, waaronder SARS-Cov-213,14.
De hersenorganoïden kunnen tot enkele millimeters in diameter reiken. De binnenste zone van de organoïde kan dus lijden aan hypoxie of ondervoeding en uiteindelijk necrotisch worden. Daarom omvatten veel protocollen speciale bioreactoren8,shakers of microfluïdische systemen15. Deze apparaten kunnen grote hoeveelheden dure celkweekmedia vereisen. Ook zijn de kosten van dergelijke apparatuur meestal hoog. Sommige bioreactoren bestaan uit veel mechanische onderdelen waardoor ze moeilijk te steriliseren zijn voor hergebruik.
De meeste protocollen lijden aan het “batch-effect”16, dat aanzienlijke variabiliteit genereert tussen organoïden verkregen uit de identieke iPSC’s. Deze variabiliteit belemmert het testen van geneesmiddelen of preklinische studies die uniformiteit vereisen. De hoge opbrengst van organoïden genoeg om organoïden van uniforme grootte te selecteren, kan dit probleem gedeeltelijk oplossen.
De factor tijd is ook een groot probleem. Matsui et al. (2018) toonden aan dat hersenorganoïden minstens zes maanden nodig hebben om volwassen te worden17. Trujillo et al. (2019) toonden ook aan dat elektrofysiologische activiteit in organoïden pas na zes maanden teeltoptrad 18. Vanwege de lange organische rijpingstijd lanceren de onderzoekers vaak nieuwe differentiatie voordat ze de vorige voltooien. Meerdere parallelle differentiatieprocessen vereisen extra kosten, apparatuur en laboratoriumruimte.
We hebben onlangs een mini-bioreactor ontwikkeld die voornamelijk de hierboven genoemde problemen oplost19. Deze zelfgemaakte bioreactor bestaat uit een ultralage hechting of onbehandelde petrischaal met een plastic knop in het midden. Deze plastic knop voorkomt verdringing van organoïden en hun conglutinatie in het midden van de petrischaal, die wordt veroorzaakt door de rotatie van de shaker. Dit artikel beschrijft hoe deze goedkope en eenvoudige zelfgemaakte mini-bioreactor het mogelijk maakt om in grote hoeveelheden hoogwaardige hersenorganoïden te genereren.
Het beschreven protocol heeft twee cruciale stappen die het genereren van hoogwaardige organoïden van uniforme grootte mogelijk maken. Ten eerste groeien de organoïden uit sferoïden die bijna identiek zijn in celnummer en celvolwassenheid. Ten tweede bieden de zelfgemaakte bioreactoren elke organoïde een uniforme omgeving, waar organoïden zich niet verdringen of aan elkaar plakken.
De celkwaliteit en de toestand van celrijping zijn essentieel om het protocol uit te voeren. Het is van cruc…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidie 075-15-2019-1669 van het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie (RT-PCR-analyse) en door subsidie nr. 19-15-00425 van de Russian Science Foundation (voor al het andere werk). De auteurs bedanken ook Pavel Belikov voor zijn hulp bij de videobewerking. Figuren in het manuscript zijn gemaakt met BioRender.com.
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |