Method Article

집에서 만든 미니 생물 반응기에서 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 오르간성 생성

DOI:

10.3791/62987

⸱

December 11th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 2Faculty of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, 3Center for Precision Genome Editing and Genetic Technologies for Biomedicine, Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine, Federal Medical Biological Agency, 4Department of Pathological Anatomy, North-Western State Medical University, 5Department of Biology, Lomonosov State University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에서 우리는 인간 유도한 다능성 줄기 세포 (iPSCs)에서 두뇌 유기체를 생성하기 위한 프로토콜을 기술합니다. 다량의 뇌 오르가노이드와 고품질의 뇌 오르가노이드를 얻기 위해, 우리는 집에서 만든 미니 생물 반응기를 사용합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSC 유래 뇌 오르가노이드는 신경계 및 약물 검진의 병리를 모델링하는 시험관 내 유망한 기술입니다. 이 기술은 최근에 등장했습니다. 아직 초기 단계에 있으며 아직 해결되지 않은 몇 가지 제한이 있습니다. 현재 프로토콜은 약물 발견 및 전임상 연구를 위해 오르가노이드를 얻는 것이 충분히 일관되지 않습니다. 오르가노이드의 성숙은 1 년까지 걸릴 수 있습니다, 동시에 여러 분화 프로세스를 시작하는 연구원을 밀어. 그것은 공간과 장비의 측면에서 실험실에 대한 추가 비용을 부과한다. 또한, 뇌 오르가노이드는 종종 중앙에 괴사 영역을 가지고, 이는 영양소와 산소 결핍으로 고통. 따라서, 대부분의 현재 프로토콜은 영양을 개선하기 위해 배양 매체에 대한 순환 시스템을 사용합니다.

한편, 오르가노이드 재배를 위한 저렴한 동적 시스템이나 생물 반응기는 없습니다. 이 논문은 컴팩트하고 저렴한 수제 미니 바이오 리액터에서 뇌 오르가노이드를 생산하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 대량으로 고품질 의 오르가노이드를 얻을 수 있습니다.

Introduction

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인간 iPSC 유래 모델은 신경 발달 및 신경 퇴행성 질환1의연구에서 널리 사용된다. 지난 10 년 동안, 3D 뇌 조직 모델, 소위 뇌 오르가노이드, 본질적으로 전통적인 2D 신경 문화를 보완2. 오르가노이드는 배아 뇌의 3D 아키텍처를 어느 정도 재구성하고 보다 정확한 모델링을 허용합니다. 대뇌 피질3,4,5,소뇌6,중뇌, 전뇌, 시상하부7,8,9,해마10: 많은 프로토콜은 다른 뇌 영역을 나타내는 오르가노이드의 생성을 위해 게시된다. 인간 신경계 질환을 연구하기 위해 오르가노이드를 사용하는 여러 가지 예가있었다(11). 또한, 오르가노이드는 약물발견(12)에서 구현되었고 SARS-Cov-2

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Protocol

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참고 : 1.2 단계와 1.3 단계를 제외하고 프로토콜 전체에 멸균 기술을 사용합니다. 세포 나 오르가노이드에 적용하기 전에 모든 배양 매체와 솔루션을 37 °C로 따뜻하게하십시오. CO2 인큐베이터에서 80% 습도에 따라 5% CO2에서 37°C에서 세포를 재배합니다. 프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다.

1. 페트리 접시를 미니 바이오 반응기로 변환

  1. 높이 7-8mm의 고리에 멸균 15 mL 원심분리기 튜브를 잘라; 링을 자동 복제합니다.
  2. 낮은 접착, 치료되지 않은 또는 미생물 페트리 접시를 부스러기로 나누기. 액체 플라스틱을 준비하기 위해 밤새 10mL의 클로로포름에 플라스틱 부스러기 1 g을 녹입니다.
    주의: 연기 후드에서 작업합니다.
  3. 결과 액체 플라스틱이 파이펫팅에 충분히 점성이 있는지 확인하십시오. 그 드롭구형 형태를 유지하고 표면에 확산되지 않습니다. 매우 액체인 경우 플라스틱 부스러기를 더 추가합니다. 두꺼운 경우 클로로폼을 추가합니다.
  4. 멸균 초저 접착 6cm 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 손잡이를 만드십시오. 아래에 자세히 설명된....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

프로토콜 구성표는 그림 1에표시됩니다. 프로토콜에는 iPSC가 적어도 한 달 동안 뇌 오르가노이드로 분화된 5개의 미디어가 포함되어 있습니다. 차별화는 iPSC가 75-90%의합류(그림 2A,B)에도달한 후 시작되었다. 세포가 "로제트"(도2C)로클러스터되기 시작했을 때 중간 A에서 iPSC 재배의 일 10-11일에 신경을 향한 분화의 첫 징후가 관찰되었다. 14-15 일, iPSCs는 신경 상피 선조로 분화했습니다. 세포의 99%는 신경피상동맥 마커 SOX1에 양성이었고 만능 세포 마커 TRA-1-81 및 OCT4(보충도면 S1)를발현하지 않았다. 그런 다음 EDTA 함유 용액을 사용하여 세포를 수확하고 마이크로웰(그림2D)을함유한 특수 24웰 배양판으로 .......

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Discussion

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설명된 프로토콜에는 균일한 크기의 고품질 오르가노이드생성을 허용하는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 오르가노이드는 세포 수와 세포 성숙도에서 거의 동일한 스페로이드에서 증가합니다. 둘째, 집에서 만든 생물 반응기는 각 오르가노이드가 군중이나 함께 붙어 있지 않는 균일 한 환경을 제공합니다.

세포 의 질과 세포 성숙의 상태는 프로토콜을 수행하는 데 필수적이다. iPSC의 75-90% 합류에서 신경 분화를 시작하는 것이 중요합니다. 세포 밀도가 너무 낮은 경우 iPSC는 비 신경 방향으로 분화 할 수 있습니다. 신경 선조는 나중에 더 취약해지기 때문에 iPSCs의 신경 유도의 2 주를 초과하지 않는 것이 중요합니다. 분화 하는 동안, 세포와 오르가노이드는 정기적으로 신선한 매체와 함께 공급 되어야 기아 가 오가노이드 품질의 급격한 감소에 이르게 하기 때문에. 단기 휴식만 동적 재배에 허용됩니다.

프로토콜의 일부 수정이 허용됩.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 러시아 연방 과학 고등 교육부 (RT-PCR 분석)의 보조금 075-15-2019-1669 및 러시아 과학 재단 (다른 모든 작업에 대한)에서 19-15-00425 호를 지원했습니다. 저자는 또한 비디오 편집에 대한 그의 도움에 대한 파벨 벨리코프에게 감사드립니다. 원고의 수치는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
고급 DMEM/F-12Gibco12634010DMEM/F-12
AggreWell400STEMCELL Technologies Inc34425마이크로웰이 있는 24웰 배양 플레이트
B-27 보충제Gibco17504044뉴런 보충제 B
GlutaMAX 보충제Gibco35050061200mM L-알라닐-L-글루타민
인간 BDNFMiltenyi Biotec130-096-285
인간 FGF-2Miltenyi Biotec130-093-839
인간 GDNFMiltenyi Biotec130-096-290
녹아웃 혈청 교체Gibco10828028혈청 교체
mTESR1STEMCELL Technologies Inc85850다분화능 줄기 세포 배지
N2 보충제Gibco
Neurobasal MediumGibco21103049신경 세포 유지를 위한 기저 배지
Penicillin-Streptomycin SolutionGibco15140130
PlasmocinInvivoGenant-mpt-1Antimicrobials
PurmorphamineEMD Millipore540220
StemMACS Y27632Miltenyi Biotec130-106-538Y27632
StemMACS 도르소모르핀Miltenyi Biotec130-104-466도르소모르핀
StemMACS LDN-193189Miltenyi Biotec130-106-540LDN-193189
StemMACS SB431542Miltenyi Biotec130-106-543SB431542
Trypan Blue SolutionGibco15250061
Versen 솔루션Gibco1504006631350010에서 0.48mM EDTA
17502001 PBSβ-메르캅토에탄올 Gibco

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
  2. Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F.

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