Generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte in mini bioreattori fatti in casa
Summary
Qui descriviamo un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC). Per ottenere organoidi cerebrali in grandi quantità e di alta qualità, utilizziamo mini bioreattori fatti in casa.
Abstract
L’organoide cerebrale derivato da iPSC è una tecnologia promettente per la modellazione in vitro delle patologie del sistema nervoso e lo screening farmacologico. Questa tecnologia è emersa di recente. È ancora agli inizi e ha alcune limitazioni ancora irrisolte. Gli attuali protocolli non consentono di ottenere organoidi sufficientemente coerenti per la scoperta di farmaci e studi preclinici. La maturazione degli organoidi può richiedere fino a un anno, spingendo i ricercatori a lanciare più processi di differenziazione contemporaneamente. Impone costi aggiuntivi per il laboratorio in termini di spazio e attrezzature. Inoltre, gli organoidi cerebrali hanno spesso una zona necrotica al centro, che soffre di carenza di nutrienti e ossigeno. Quindi, la maggior parte dei protocolli attuali utilizza un sistema circolante per il terreno di coltura per migliorare la nutrizione.
Nel frattempo, non ci sono sistemi dinamici economici o bioreattori per la coltivazione di organoidi. Questo documento descrive un protocollo per la produzione di organoidi cerebrali in mini bioreattori fatti in casa compatti ed economici. Questo protocollo consente di ottenere organoidi di alta qualità in grandi quantità.
Introduction
I modelli umani derivati da iPSC sono ampiamente utilizzati negli studi sui disturbi dello sviluppo neurologico e neurodegenerativo1. Negli ultimi dieci anni, i modelli di tessuto cerebrale 3D, i cosiddetti organoidi cerebrali, hanno essenzialmente completato le tradizionali colture neuronali 2D2. Gli organoidi ricapitolano in una certa misura l’architettura 3D del cervello embrionale e consentono una modellazione più precisa. Molti protocolli sono pubblicati per la generazione di organoidi che rappresentano diverse regioni del cervello: corteccia cerebrale3,4,5,cervelletto6,mesencefalo,encefalo, ipotalamo7,8,9e ippocampo10. Ci sono stati diversi esempi di utilizzo di organoidi per studiare le malattie del sistema nervoso umano11. Inoltre, gli organoidi sono stati implementati nelle scoperte di farmaci12 e utilizzati in studi di malattie infettive, tra cui SARS-Cov-213,14.
Gli organoidi cerebrali possono raggiungere fino a diversi millimetri di diametro. Quindi, la zona interna dell’organoide può soffrire di ipossia o malnutrizione e alla fine diventare necrotica. Pertanto, molti protocolli includono bioreattori speciali8, scuotitori o sistemi microfluidici15. Questi dispositivi possono richiedere grandi volumi di costosi supporti di coltura cellulare. Inoltre, il costo di tali apparecchiature è solitamente elevato. Alcuni bioreattori sono costituiti da molte parti meccaniche che li rendono difficili da sterilizzare per il riutilizzo.
La maggior parte dei protocolli soffre dell'”effetto batch”16, che genera una variabilità significativa tra gli organoidi ottenuti dalle iPSC identiche. Questa variabilità ostacola i test antidroga o gli studi preclinici che richiedono uniformità. L’alta resa di organoidi sufficiente per selezionare organoidi di dimensioni uniformi può parzialmente risolvere questo problema.
Anche il fattore tempo è un problema significativo. Matsui et al. (2018) hanno dimostrato che gli organoidi cerebrali richiedono almeno sei mesi per raggiungere la maturità17. Trujillo et al. (2019) hanno anche dimostrato che l’attività elettrofisiologica si è verificata negli organoidi solo dopo sei mesi di coltivazione18. A causa del lungo tempo di maturazione degli organoidi, i ricercatori spesso lanciano una nuova differenziazione prima di completare la precedente. Molteplici processi paralleli di differenziazione richiedono spese aggiuntive, attrezzature e spazio di laboratorio.
Abbiamo recentemente sviluppato un mini bioreattore che risolve principalmente i problemi sopra menzionati19. Questo bioreattore fatto in casa è costituito da un’adesione ultra-bassa o da una capsula di Petri non trattata con una manopola di plastica al centro. Questa manopola in plastica impedisce l’affollamento degli organoidi e la loro conglutinazione al centro della capsula di Petri, causata dalla rotazione dello shaker. Questo documento descrive come questo mini bioreattore fatto in casa economico e semplice consente di generare organoidi cerebrali di alta qualità in grandi quantità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto ha due passaggi cruciali che consentono la generazione di organoidi di alta qualità di dimensioni uniformi. In primo luogo, gli organoidi crescono da sferoidi che sono quasi identici nel numero di cellule e nella maturità cellulare. In secondo luogo, i bioreattori fatti in casa forniscono a ciascun organoide un ambiente uniforme, in cui gli organoidi non si affollano o si attaccano insieme.
La qualità cellulare e lo stato di maturazione cellulare sono essenziali per …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione 075-15-2019-1669 del Ministero della Scienza e dell’Istruzione Superiore della Federazione Russa (analisi RT-PCR) e dalla sovvenzione n. 19-15-00425 della Russian Science Foundation (per tutti gli altri lavori). Gli autori ringraziano anche Pavel Belikov per il suo aiuto con l’editing video. Le figure nel manoscritto sono state create con BioRender.com.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
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