Brain Organoid Generation från inducerade pluripotenta stamceller i hemgjorda minibioreaktorer
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att generera hjärnan organoider från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). För att få hjärnorganoider i stora mängder och av hög kvalitet använder vi hemgjorda minibioreaktorer.
Abstract
Den iPSC-härledda hjärnan organoid är en lovande teknik för in vitro modellering patologier i nervsystemet och drog screening. Denna teknik har dykt upp nyligen. Det är fortfarande i sin linda och har vissa begränsningar olösta ännu. De nuvarande protokollen tillåter inte att erhålla organoider är tillräckligt konsekventa för läkemedelsupptäckt och prekliniska studier. Mognaden av organoider kan ta upp till ett år, vilket driver forskarna att starta flera differentieringsprocesser samtidigt. Det medför extra kostnader för laboratoriet i form av utrymme och utrustning. Dessutom har hjärnorganoider ofta en nekrotisk zon i mitten, som lider av närings- och syrebrist. Därför använder de flesta nuvarande protokoll ett cirkulerande system för odlingsmedium för att förbättra näring.
Under tiden finns det inga billiga dynamiska system eller bioreaktorer för organoid odling. Detta dokument beskriver ett protokoll för att producera hjärnan organoider i kompakta och billiga hemgjorda mini bioreaktorer. Detta protokoll gör det möjligt att erhålla högkvalitativa organoider i stora mängder.
Introduction
Mänskliga iPSC-härledda modeller används ofta i studierna av neurodevelopmental och neurodegenerativa sjukdomar1. Under det senaste decenniet kompletterade 3D-hjärnvävnadsmodeller, så kallade hjärnorganoider, i huvudsak traditionella 2D-neuronala kulturer2. Organoiderna rekapitulerar i viss utsträckning den embryonala hjärnans 3D-arkitektur och tillåter mer exakt modellering. Många protokoll publiceras för generering av organoider som representerar olika hjärnregioner: hjärnbarken3,4,5, lillhjärnan6, midbrain, forebrain, hypotalamus7,8,9och hippocampus10. Det har funnits flera exempel på att använda organoider för att studera sjukdomar i nervsystemet11. Organoiderna genomfördes också i läkemedelsupptäckter12 och användes i studier av infektionssjukdomar, inklusive SARS-Cov-213,14.
Hjärnans organoider kan nå upp till flera millimeter i diameter. Så kan den inre zonen av organoiden drabbas av hypoxi eller undernäring och så småningom bli nekrotisk. Därför innehåller många protokoll speciella bioreaktorer8,shakers eller mikrofluidiska system15. Dessa enheter kan kräva stora volymer dyra cellkulturmedier. Kostnaden för sådan utrustning är också vanligtvis hög. Vissa bioreaktorer består av många mekaniska delar som gör dem svåra att sterilisera för återanvändning.
De flesta protokoll lider av “batcheffekten”16, vilket genererar betydande variabilitet bland organoider som erhållits från identiska iPSCs. Denna variabilitet hindrar drogtester eller prekliniska studier som kräver enhetlighet. Det höga utbytet av organoider tillräckligt för att välja organoider av enhetlig storlek kan delvis lösa detta problem.
Tidsfaktorn är också ett betydande problem. (2018) visade att hjärnorganoider kräver minst sex månader för att nå mognad17. (2019) visade också att elektrofysiologisk aktivitet inträffade i organoider först efter sex månaders odling18. På grund av den långa orgeloidmagnadstiden lanserar forskarna ofta ny differentiering innan de slutför den tidigare. Flera parallella differentieringsprocesser kräver extra kostnader, utrustning och laboratorieutrymme.
Vi har nyligen utvecklat en mini bioreaktor som främst löser de problem som nämns ovan19. Denna hemgjorda bioreaktor består av en ultralåg vidhäftning eller obehandlad Petri-maträtt med en plastknopp i mitten. Denna plastknopp förhindrar trängsel av organoider och deras konglutination i mitten av Petri-skålen, vilket orsakas av skakapparatens rotation. Detta dokument beskriver hur denna billiga och enkla hemgjorda mini bioreaktor gör det möjligt att generera högkvalitativa hjärnorganoider i stora mängder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det beskrivna protokollet har två avgörande steg som gör det möjligt att generering av högkvalitativa organoider av enhetlig storlek. För det första växer organoiderna från sfäroider som är nästan identiska i cellnummer och cellmognad. För det andra ger de hemgjorda bioreaktorerna varje organoid en enhetlig miljö, där organoider inte trängs eller håller ihop.
Cellkvaliteten och tillståndet för cellmognad är avgörande för att utföra protokollet. Det är viktigt att starta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av anslag 075-15-2019-1669 från Ryska federationens ministerium (RT-PCR-analys) och genom bidrag nr 19-15-00425 från Ryska vetenskapsstiftelsen (för allt annat arbete). Författarna tackar också Pavel Belikov för hans hjälp med videoredigeringen. Figurer i manuskriptet skapades med BioRender.com.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
