تشريح الغدد اللعابية اليرقات من البعوض الغامبي Anopheles و المناعة
Summary
الغدة اللعابية للبعوض البالغة (SG) مطلوبة لنقل جميع مسببات الأمراض المنقولة بالبعوض إلى مضيفيهم البشريين ، بما في ذلك الفيروسات والطفيليات. يوضح هذا الفيديو العزلة الفعالة ل SGs عن مرحلة اليرقات (L4) بعوض Anopheles gambiae وإعداد L4 SGs لمزيد من التحليل.
Abstract
الغدد اللعابية البعوض (SGs) هي جهاز بوابة المطلوبة لانتقال مسببات الأمراض التي تنقلها الحشرات. تتراكم العوامل المسببة للأمراض، بما في ذلك الفيروسات وطفيليات البلازموديوم التي تسبب الملاريا، في التجاويف الإفرازية لخلايا SG. هنا ، يستعدون لانتقال العدوى إلى مضيفيهم الفقاريين خلال وجبة دم لاحقة. كما تشكل الغدد البالغة كصياغة لبقايا برعم القناة SG اليرقات التي تستمر إلى ما بعد انحلال الهستوليسيس SG الجرو المبكر ، فإن SG اليرقات هي هدف مثالي للتدخلات التي تحد من انتقال المرض. يمكن أن يساعد فهم تطوير اليرقات في تطوير فهم أفضل لمورفولوجيا اليرقات والتكيفات الوظيفية والمساعدة في تقييم التدخلات الجديدة التي تستهدف هذا الجهاز. يوضح بروتوكول الفيديو هذا تقنية فعالة لعزل وإصلاح وتلطيخ اليرقات من البعوض الغامبي Anopheles. يتم إصلاح الغدد التي يتم تشريحها من اليرقات في محلول الإيثانول بنسبة 25٪ في خليط حمض الخليك الميثانول الجليدي ، يليه غسل الأسيتون البارد. بعد بضعة شطف في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) ، يمكن أن تكون ملطخة SGs مع مجموعة واسعة من الأصباغ علامة و / أو antisera ضد البروتينات التي أعرب عنها SG. يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لعزل اليرقات SG لجمع الأنسجة لتحليل التهجين في الموقع ، والتطبيقات النسخية الأخرى ، والدراسات البروتيوميكية.
Introduction
الملاريا هي تهديد رئيسي للصحة العامة تسبب ما يقرب من 230 مليون إصابة وما يقدر ب 409,000 حالة وفاة في عام 20191. غالبية الوفيات في أفريقيا جنوب الصحراء الكبرى وتسببها الطفيلي بلازموديوم فالسيباروم، الذي ناقل الحشرات هو Anopheles gambiae، موضوع هذا العرض التوضيحي بالفيديو. وعلى الرغم من أن الأرقام تشير إلى انخفاض كبير في معدل الوفيات السنوي منذ مطلع القرن (انخفاض عدد الوفيات السنوية بمقدار 300,000 >)، فإن الانخفاضات الواعدة في معدلات الأمراض التي لوحظت في الفترة من عام 2000 إلى عام 2015 آخذة في الانخفاض، مما يشير إلى الحاجة إلى نهج جديدة للحد من انتقال الأمراض2. ومن بين الاستراتيجيات الإضافية الواعدة لمكافحة الملاريا وربما القضاء عليها استهداف قدرة البعوض الناقلة باستخدام تحرير الجينات المستندة إلى CRISPR/Cas9 ومحرك الجينات3و4و5. والواقع أن استهداف ناقل البعوض (من خلال التوسع في استخدام الناموسيات المعالجة بمبيدات الحشرات) هو الذي كان له أكبر الأثر على الحد من انتقال الأمراض6.
البعوض الإناث الحصول على خلايا اللعبة البلازموديوم من الإنسان المصاب خلال وجبة الدم. بعد الإخصاب والنضج واجتياز الظهارة الوسطى والتوسع السكاني والملاحة الهيموكويل في مضيفيهم البعوض ملزمة، ومئات إلى عشرات الآلاف من sporozoites البلازموديوم غزو SGs البعوض وملء تجاويف إفراز الخلايا إفراز constituent. مرة واحدة داخل تجاويف إفرازية ، والطفيليات والوصول المباشر إلى القناة اللعابية ، وبالتالي تستعد لانتقال العدوى إلى مضيف الفقاريات الجديدة على وجبة الدم المقبل. ولأن مجموعات ال SGs حاسمة لانتقال الزنجة المسببة للملاريا إلى مضيفيهم البشريين، وتشير الدراسات المختبرية إلى أن ال SGs ليست ضرورية لتغذية الدم أو بقاء البعوض أو البراز7و8و9،فإنها تمثل هدفا مثاليا لتدابير منع انتقال العدوى. تشكل SGs البعوض الكبار كصياغة لبقايا “برعم القناة” في SGs اليرقات التي تستمر إلى ما بعد انحلال الهستوليسيس SGالمبكر 10، مما يجعل اليرقات SG هدفا مثاليا للتدخلات للحد من انتقال المرض في مرحلة البلوغ.
إن توصيف مرحلة اليرقات في تطوير SG يمكن أن يساعد ليس فقط في تطوير فهم أفضل لمورفولوجيا وتكييفاته الوظيفية ولكن يمكن أن يساعد أيضا في تقييم التدخلات الجديدة التي تستهدف هذا الجهاز من خلال تحرير الجينات من المنظمين الرئيسيين في SG. لأن جميع الدراسات السابقة لهندسة الغدة اللعابية اليرقات تسبق التصبغ المناعي وتقنيات التصويرالحديثة 10،11، فقد وضعنا بروتوكولا لعزل وتلطيخ الغدد اللعابية مع مجموعة متنوعة من الأجسام المضادة وعلامات الخلية12. يوضح هذا الفيديو هذا النهج لاستخراج تثبيت وتلطيخ اليرقات SGs من يرقات Anopheles gambiae L4 للتصوير البؤري.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم تكييف البروتوكول الموصوف هنا من بروتوكول تشريح Drosophila SG وبروتوكول تشريح البعوض البالغ14و15و16. ومع ذلك ، فإن معظم العلامات لم تخترق غشاء الطابق السفلي (البيانات غير المعروضة) عند استخدام طرق تشريح الكبار وتلطيخ SG. وشملت تعديلات بروتوكول ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونود أن نشكر معهد جونز هوبكنز لأبحاث الملاريا على إمكانية الوصول إلى يرقات أنغامبيا وتربية هذه اليرقات.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
