Dissektion og immunstaining af larve spytkirtler fra Anopheles gambiae Myg
Summary
Den voksne myg spytkirtel (SG) er nødvendig for overførsel af alle mygbårne patogener til deres menneskelige værter, herunder vira og parasitter. Denne video viser effektiv isolering af verdensmålene fra larvestadiet Anopheles gambiae myg og forberedelse af L4-målene til yderligere analyse.
Abstract
Mosquito spytkirtler (SGs) er et nødvendigt gatewayorgan til overførsel af insektbårne patogener. Sygdomsfremkaldende stoffer, herunder vira og Plasmodium parasitter, der forårsager malaria, ophobes i sekretoriske hulrum af SG-celler. Her er de klar til at blive sendt til deres hvirveldyr værter under et efterfølgende blodmåltid. Som voksne kirtler form som en uddybning af larve SG kanal bud rester, der fortsætter ud over tidlig pupal SG histolyse, larven SG er et ideelt mål for interventioner, der begrænser sygdomsoverførsel. Forståelse af larval SG udvikling kan bidrage til at udvikle en bedre forståelse af dens morfologi og funktionelle tilpasninger og støtte i vurderingen af nye interventioner, der er rettet mod dette organ. Denne videoprotokol demonstrerer en effektiv teknik til isolering, fastgørelse og farvning af larval-SGs fra Anopheles gambiae myg. Kirtler dissekeret fra larver i en 25% ethanolopløsning er fastgjort i en metanol-glacial eddikesyreblanding efterfulgt af en kold acetonevask. Efter et par skylninger i fosfat-buffered saltvand (PBS), SGs kan farves med en bred vifte af markør farvestoffer og / eller antisera mod SG-udtrykte proteiner. Denne metode til larval SG isolation kunne også bruges til at indsamle væv til in situ hybridisering analyse, andre transskriptomiske applikationer, og proteomiske undersøgelser.
Introduction
Malaria er en stor trussel mod folkesundheden, der forårsager næsten 230 millioner infektioner og anslået 409.000 dødsfald i 20191. De fleste dødsfald er i Afrika syd for Sahara og er forårsaget af parasitten Plasmodium falciparum, hvis insekt vektor er Anopheles gambiae, emnet for denne video demonstration. Selv om tallene tyder på et betydeligt fald i den årlige dødelighed siden århundredeskiftet (> 300.000 færre årlige dødsfald), er de lovende fald i sygdomsraterne observeret fra 2000 til 2015 aftagende, hvilket tyder på behovet for nye tilgange til begrænsning af sygdomsoverførsel2. Blandt lovende yderligere strategier for kontrol og eventuelt eliminering af malaria er rettet mod myg vektor kapacitet ved hjælp af CRISPR / Cas9-baserede gen-redigering og gen-drev3,4,5. Faktisk er det målretningen af mygvektoren (gennem udvidet brug af langvarige insekticidbehandlede sengenet), der har haft den største indvirkning på reduktionen af sygdomsoverførsel6.
Kvindelige myg erhverver Plasmodium gametocytter fra et inficeret menneske under et blodmåltid. Efter befrugtning, modning, midgut epitel traversal, befolkning ekspansion, og hæmocoel navigation i deres obligatoriske myg værter, hundreder til titusinder af Plasmodium sporozoitter invadere myggsgs og fylde sekretoriske hulrum af de konstituerende sekretoriske celler. Når de er inde i sekretorhulerne, har parasitterne direkte adgang til spytkanalen og er således klar til overførsel til en ny hvirveldyr vært ved det næste blodmåltid. Fordi SGs er afgørende for overførsel af malaria-forårsager sporozoitter til deres menneskelige værter, og laboratorieundersøgelser tyder på, at SGs ikke er afgørende for blod-fodring, myg overlevelse, eller fecundity7,8,9, de repræsenterer et ideelt mål for transmission-blokering foranstaltninger. Voksne myggsgs danner som en uddybning af “kanalknoppe” rester i larvensgs, der fortsætter ud over tidlig pupal SG histolyse10, hvilket gør larven SG til et ideelt mål for interventioner for at begrænse overførsel af voksenstadiet sygdom.
Karakterisering af larvestadiet for udvikling af bæredygtig udvikling kan hjælpe med at udvikle ikke kun en bedre forståelse af dets morfologi og funktionelle tilpasninger, men kan også hjælpe med at vurdere nye interventioner, der målretter dette organ gennem genredigering af vigtige SG-tilsynsmyndigheder. Fordi alle tidligere undersøgelser af larve spytkirt arkitektur forud for immunstaining og moderne billeddannelse teknikker10,11, vi har udviklet en protokol for isolering og farvning spytkirtler med en række antistoffer og celle markører12. Denne video viser denne tilgang til udvinding, fiksering og farvning af larvensgs fra Anopheles gambiae L4 larver til konfokal billeddannelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet heri blev tilpasset fra en Drosophila SG dissektion protokol og en voksen myg dissektion protokol14,15,16. De fleste markører trængte dog ikke ind i kældermembranen (data, der ikke blev vist), når de brugte metoderne til farvning af voksne dissektioner og SG-farvninger. Tilpasninger af den voksne protokol omfattede dissekering af kirtlerne i en 25% EtOH-opløsning, vask af kirtlerne med en kombination a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Johns Hopkins Malaria Research Institute for adgang til og opdræt af An. gambiae larver.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020)
- Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
- Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
- Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
- Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
- Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
- Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
- Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
- Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
- Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
- Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
- MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ (2015)
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
- Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
- Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
- Clements, A. N. . The physiology of mosquitoes. , (1963).
- Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
- Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
- Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
- Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
- Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).
