アノフェレスガンビー蚊からの幼虫唾液腺の解剖と免疫染色
Summary
成体の蚊の唾液腺(SG)は、ウイルスや寄生虫を含む人間の宿主にすべての蚊媒介病原体の伝染に必要である。このビデオは、幼虫(L4)ステージ アノフェレスガンビア 蚊からのSGの効率的な分離とさらなる分析のためのL4 SGの調製を示しています。
Abstract
蚊の唾液腺(SG)は、昆虫媒介病原体の伝染に必要なゲートウェイ器官である。ウイルスやマラリアを引き起こすマラリア原虫を含む疾患を引き起こす薬剤は、SG細胞の分泌空洞に蓄積する。ここでは、その後の血液食事中に脊椎動物の宿主に伝染する準備ができています。成人の腺は、幼虫SG芽の残骸の精緻化として形成され、初期のプパルSGのヒストリシスを超えて持続するので、幼虫SGは病気の伝染を制限する介入のための理想的な標的である。幼虫SGの開発を理解することは、その形態と機能的適応のより良い理解を開発し、この器官を標的とする新しい介入の評価に役立ちます。このビデオプロトコルは、 アノフェレスガンビア 蚊から幼虫SGを単離、固定、染色するための効率的な技術を示しています。25%エタノール溶液中で幼虫から解剖した腺は、メタノール・氷酢酸混合物中に固定され、続いて冷たいアセトン洗浄が行われます。リン酸緩衝生理食塩分(PBS)で数回のリンスの後、SG発現タンパク質に対する広範なマーカー染料および/またはアンチセラでSGを染色することができます。幼虫SGの分離のためのこの方法はまた、 その他の転 写応用、およびプロテオミクス研究における組織を収集するために使用することができる。
Introduction
マラリアは公衆衛生上の主要な脅威であり、2019年には約2億3000万人の感染と推定409,000人の死亡を引き起こしている。死者の大半はサハラ以南のアフリカで、このビデオデモンストレーションの主題であるアノフェレス・ガンビアである寄生虫熱帯熱マラリア原虫によって引き起こされます。この数字は、世紀の変わり目以来、年間死亡率の大幅な低下(年間死亡者数>30万人減少)を示しているが、2000年から2015年まで観察された疾患率の有望な減少は先細りであり、疾患伝染を制限するための新しいアプローチの必要性を示唆している2。マラリアを制御し、おそらく排除するための有望な追加戦略の中で、CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集および遺伝子駆動3、4、5を使用して蚊ベクター容量を標的にしている。実際、病気の伝染を減らすに最も大きな影響を与えたのは、蚊ベクターの標的化(長期にわたる殺虫剤処理されたベッドネットの拡大を通じて)である。
雌の蚊は、血液中に感染したヒトからプラスモジウム様の解剖学を取得する。受精、成熟、中腸上皮横断、集団拡張、および彼らの義務的な蚊の宿主におけるヘモコウムナビゲーションに続いて、数百から数万のプラスモジウム・スポロゾイテが蚊SGに侵入し、構成分泌細胞の分泌空洞を埋める。分泌空洞内に入ると、寄生虫は唾液管に直接アクセスし、次の血液食事時に新しい脊椎動物宿主に伝染する準備ができている。SGはマラリアを引き起こすスポロゾアをヒト宿主に伝染させるのに重要であり、実験室での研究は、SGが血液供給、蚊の生存、または胎児性7、8、9に不可欠ではないことを示唆しているので、伝達遮断対策の理想的な標的である。成虫の蚊SGは、初期の子犬SGヒストリシス10を超えて持続する幼虫SGの「ダクト芽」残骸の精緻化として形成され、幼虫SGは成人期疾患の伝染を制限するための介入のための理想的な標的となる。
SG開発の幼虫段階を特徴付けても、その形態と機能適応の理解を深めるだけでなく、主要なSGレギュレータの遺伝子編集を通じてこの器官を標的とする新しい介入を評価するのにも役立ちます。幼虫唾液腺アーキテクチャのこれまでの研究は、免疫染色および現代のイメージング技術10,11より前に、種々の抗体および細胞マーカー12を用いて唾液腺を単離および染色するためのプロトコルを開発した。このビデオは、共焦点イメージングのためのアノフェレスガンビアL4幼虫からの幼虫SGの抽出、固定、染色に対するこのアプローチを示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載されたプロトコルは、ショウジョウバエSG解剖プロトコルおよび成体蚊解剖プロトコル14、15、16から適応した。しかし、成人解剖およびSG染色法を使用する場合、ほとんどのマーカーは、元素膜(データは示さない)に浸透しなかった。成人プロトコルの適応には、25%のEtOH溶液中の腺の解剖、MeOHと氷河酢酸の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジョンズ・ホプキンスマラリア研究所の アンガンビア 幼虫へのアクセスと飼育に感謝します。
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
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