Dissecção e Imunostaining de Glândulas Salivares Larvais de Anopheles gambiae Mosquitos
Summary
A glândula salivar de mosquito adulto (SG) é necessária para a transmissão de todos os patógenos transmitidos por mosquitos para seus hospedeiros humanos, incluindo vírus e parasitas. Este vídeo demonstra o isolamento eficiente das OGs do estágio larval (L4) dos mosquitos Anopheles gambiae e a preparação dos SGs L4 para análise posterior.
Abstract
As glândulas salivares de mosquitos (OG) são um órgão de entrada necessário para a transmissão de patógenos transmitidos por insetos. Agentes causadores de doenças, incluindo vírus e parasitas do Plasmodium que causam malária, se acumulam nas cavidades secretas das células SG. Aqui, eles estão prontos para transmissão para seus hospedeiros vertebrados durante uma refeição sanguínea subsequente. À medida que as glândulas adultas se formam como uma elaboração de restos de brotos de sg larval que persistem além da histolise da SG pupal precoce, a SG larval é um alvo ideal para intervenções que limitam a transmissão da doença. Compreender o desenvolvimento de SG larval pode ajudar a desenvolver uma melhor compreensão de sua morfologia e adaptações funcionais e auxiliar na avaliação de novas intervenções que visam esse órgão. Este protocolo de vídeo demonstra uma técnica eficiente para isolar, fixar e colorir os GGs larvais dos mosquitos Anopheles gambiae. As glândulas dissecadas de larvas em uma solução de 25% de etanol são fixadas em uma mistura de ácido acético metanol-glacial, seguida por uma lavagem de acetona fria. Depois de algumas enxaguadas em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), as SGs podem ser manchadas com uma ampla gama de corantes marcadores e/ou antisera contra proteínas expressas por SG. Este método para o isolamento de SG larval também poderia ser usado para coletar tecidos para análise de hibridização in situ, outras aplicações transcriômicas e estudos proteômicos.
Introduction
A malária é uma grande ameaça à saúde pública que causa quase 230 milhões de infecções e cerca de 409 mil mortes em 20191. A maioria das mortes está na África subsaariana e são causadas pelo parasita Plasmodium falciparum, cujo vetor de insetos é Anopheles gambiae, o tema desta demonstração de vídeo. Embora os números indiquem uma queda significativa na taxa anual de mortalidade desde a virada do século (>300.000 mortes anuais a menos), as reduções promissoras nas taxas de doença observadas de 2000 a 2015 estão diminuindo, sugerindo a necessidade de novas abordagens para limitar a transmissão da doença2. Entre as estratégias adicionais promissoras para controlar e possivelmente eliminar a malária está a capacidade de vetores de mosquitos usando a edição de genes baseada em CRISPR/Cas9 e unidade genética3,4,5. De fato, é o direcionamento do vetor de mosquitos (através do uso expandido de redes de cama tratadas com inseticida de longa duração) que teve o maior impacto na redução da transmissão da doença6.
Mosquitos fêmeas adquirem gametocitos de Plasmodium de um humano infectado durante uma refeição de sangue. Após fertilização, maturação, travessia de epitélio médio, expansão populacional e navegação de hemocoel em seus obrigatórios hospedeiros de mosquitos, centenas a dezenas de milhares de esporozoitas plasmodium invadem os mosquitos SGs e preenchem as cavidades secretas das células secretas constituintes. Uma vez dentro das cavidades secretas, os parasitas têm acesso direto ao ducto salivar e, portanto, estão preparados para a transmissão para um novo hospedeiro vertebrado na próxima refeição sanguínea. Como os OG são fundamentais para a transmissão de esporozoitas causadores da malária para seus hospedeiros humanos, e estudos laboratoriais sugerem que os GGs não são essenciais para a alimentação sanguínea, sobrevivência de mosquitos ou fecundidade7,8,9, representam um alvo ideal para medidas de bloqueio de transmissão. Os SGs do mosquito adulto formam-se como uma elaboração de remanescentes de “brotos de ducto” nos GGs larvais que persistem além da histolise pupal10,tornando a SG larval um alvo ideal para intervenções para limitar a transmissão da doença em estágio adulto.
Caracterizar o estágio larval do desenvolvimento de SG pode ajudar a desenvolver não apenas uma melhor compreensão de suas morfologia e adaptações funcionais, mas também pode ajudar na avaliação de novas intervenções que visam esse órgão através da edição de genes dos principais reguladores de SG. Como todos os estudos anteriores da arquitetura das glândulas salivares larvais antecedem as técnicas modernas de imunossuagem e de imagem moderna10,11, desenvolvemos um protocolo para isolar e manchar glândulas salivares com uma variedade de anticorpos e marcadores celulares12. Este vídeo demonstra essa abordagem para a extração, fixação e coloração de GGs larvas de larvas de Anopheles gambiae L4 larvas para imagens confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito foi adaptado a partir de um protocolo de dissecção Drosophila SG e um protocolo de dissecção de mosquitosadultos 14,15,16. No entanto, a maioria dos marcadores não penetrou na membrana do porão (dados não mostrados) ao utilizar os métodos de dissecção adulta e coloração de SG. As adaptações do protocolo adulto incluíram dissecar as glândulas em uma solução de 25% etoh, lavar as glându…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer ao Instituto johns Hopkins de pesquisa de malária pelo acesso e criação de larvas an. gambiae.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
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