Dissezione e immunocolorazione delle ghiandole salivari larvali da zanzare Anopheles gambiae
Summary
La ghiandola salivare della zanzara adulta (SG) è necessaria per la trasmissione di tutti gli agenti patogeni trasmessi dalle zanzare ai loro ospiti umani, inclusi virus e parassiti. Questo video dimostra l’efficiente isolamento degli SG dalle zanzare Anopheles gambiae allo stadio larvale (L4) e la preparazione degli SG L4 per ulteriori analisi.
Abstract
Le ghiandole salivari delle zanzare (SG) sono un organo gateway necessario per la trasmissione di agenti patogeni trasmessi dagli insetti. Gli agenti che causano malattie, compresi i virus e i parassiti del Plasmodium che causano la malaria, si accumulano nelle cavità secretorie delle cellule SG. Qui, sono pronti per la trasmissione ai loro ospiti vertebrati durante un successivo pasto di sangue. Mentre le ghiandole adulte si formano come un’elaborazione di resti di gemme del dotto SG larvale che persistono oltre l’istolisi SG pupale precoce, l’SG larvale è un bersaglio ideale per interventi che limitano la trasmissione della malattia. Comprendere lo sviluppo del SG larvale può aiutare a sviluppare una migliore comprensione della sua morfologia e degli adattamenti funzionali e aiutare nella valutazione di nuovi interventi che mirano a questo organo. Questo protocollo video dimostra una tecnica efficiente per isolare, fissare e colorare gli SG larvali dalle zanzare Anopheles gambiae. Le ghiandole sezionate dalle larve in una soluzione di etanolo al 25% sono fissate in una miscela di metanolo e acido acetico glaciale, seguita da un lavaggio a freddo con acetone. Dopo alcuni risciacqui in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), gli SG possono essere colorati con una vasta gamma di coloranti marcatori e / o antisieri contro le proteine espresse SG. Questo metodo per l’isolamento SG larvale potrebbe anche essere utilizzato per raccogliere tessuto per l’analisi di ibridazione in situ, altre applicazioni trascrittomiche e studi proteomici.
Introduction
La malaria è una delle principali minacce per la salute pubblica che causa quasi 230 milioni di infezioni e circa 409.000 morti nel 20191. La maggior parte dei decessi si trova nell’Africa sub-sahariana e sono causati dal parassita Plasmodium falciparum,il cui insetto vettore è Anopheles gambiae,oggetto di questo video dimostrativo. Sebbene i numeri indichino un calo significativo del tasso di mortalità annuale dall’inizio del secolo (> 300.000 decessi annuali in meno), le promettenti diminuzioni dei tassi di malattia osservate dal 2000 al 2015 si stanno assottigliando, suggerendo la necessità di nuovi approcci per limitare la trasmissione della malattia2. Tra le promettenti strategie aggiuntive per controllare e possibilmente eliminare la malaria c’è il targeting della capacità del vettore di zanzara utilizzando l’editing genetico basato su CRISPR / Cas9 e il gene-drive3,4,5. In effetti, è il targeting del vettore di zanzare (attraverso l’uso esteso di zanzariere trattate con insetticidi di lunga durata) che ha avuto il maggiore impatto sulla riduzione della trasmissione della malattia6.
Le zanzare femmine acquisiscono gametociti di Plasmodium da un essere umano infetto durante un pasto di sangue. Dopo la fecondazione, la maturazione, l’attraversamento dell’epitelio dell’intestino medio, l’espansione della popolazione e la navigazione dell’emocoel nei loro ospiti di zanzara obbligati, centinaia di decine di migliaia di sporozoiti di Plasmodium invadono i SG di zanzara e riempiono le cavità secretorie delle cellule secretorie costituenti. Una volta all’interno delle cavità secretorie, i parassiti hanno accesso diretto al dotto salivare e sono quindi pronti per la trasmissione a un nuovo ospite vertebrato al successivo pasto di sangue. Poiché gli SG sono fondamentali per la trasmissione degli sporozoiti che causano la malaria ai loro ospiti umani e gli studi di laboratorio suggeriscono che gli SG non sono essenziali per l’alimentazione del sangue, la sopravvivenza delle zanzare o la fecondità7,8,9,rappresentano un obiettivo ideale per le misure di blocco della trasmissione. Gli SG di zanzara adulta si formano come un’elaborazione di resti di “gemme del dotto” negli SG larvali che persistono oltre l’istolisi SG pupale precoce10, rendendo la SG larvale un bersaglio ideale per interventi per limitare la trasmissione della malattia in stadio adulto.
Caratterizzare lo stadio larvale dello sviluppo SG può aiutare a sviluppare non solo una migliore comprensione della sua morfologia e degli adattamenti funzionali, ma può anche aiutare a valutare nuovi interventi che prendono di mira questo organo attraverso l’editing genico dei regolatori chiave sg. Poiché tutti gli studi precedenti sull’architettura della ghiandola salivare larvale precedono l’immunocolorazione e le moderne tecniche di imaging10,11,abbiamo sviluppato un protocollo per isolare e colorare le ghiandole salivari con una varietà di anticorpi e marcatori cellulari12. Questo video dimostra questo approccio all’estrazione, alla fissazione e alla colorazione di SG larvali da larve di Anopheles gambiae L4 per l’imaging confocale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo qui descritto è stato adattato da un protocollo di dissezione Drosophila SG e da un protocollo di dissezione delle zanzare adulte14,15,16. Tuttavia, la maggior parte dei marcatori non è penetrata nella membrana basale (dati non mostrati) quando si utilizzano i metodi di dissezione per adulti e colorazione SG. Gli adattamenti del protocollo per adulti includevano la dissezione delle ghiandole in una soluzione di E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Johns Hopkins Malaria Research Institute per l’accesso e l’allevamento delle larve di An. gambiae.
Materials
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P9791 | |
| Na2HPO4 • 2H2O | Millipore Sigma | 71643 | |
| NaCl | Millipore Sigma | S7653 | |
| Acetone | Millipore Sigma | 179124 | |
| Brush with soft bristles | Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set | B08LH63D89 | |
| Cover slips (22 x 50 mm) | VWR | 48393-195 | |
| DAPI (DNA) | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Millipore Sigma | EX0276 | |
| Gilson Pipetman P200 Pipette | Gilson | P200 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | 695092 | |
| Jewelers forceps, Dumont No. 5 | Millipore Sigma | F6521 | |
| KCl | Millipore Sigma | 58221 | |
| Methanol | Millipore Sigma | 1414209 | |
| Nail polish | Amazon (Sally Hansen) | B08148YH9M | |
| Nile Red (lipid) | ThermoFisher Scientific | N1142 | |
| Paper towels/wipes | ULINE | S-7128 | |
| Petri plate (to make putty plate) | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | |
| Pipette Tips | Gilson | Tips E200ST | |
| Plastic Transfer Pipette | Fisher Scientific | S304671 | |
| Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab | Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11 | |
| Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) | ThermoFisher Scientific | A11008 | |
| Silicone resin and curing agent for putty plate | Dow Chemicals – Ximeter Silicone | PMX-200 | |
| Slides, frosted on one end for labelling | VWR 20 X 50 mm | 48393-195 | |
| Wheat Germ Agglutinin | ThermoFisher Scientific | W834 |
References
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