Följande protokoll beskriver utvecklingen och optimeringen av ett arbetsflöde med hög genomströmning för maskodling, fluorescensavbildning och automatiserad bildbehandling för att kvantifiera polyglutaminaggregat som en bedömning av förändringar i proteostas.
En ökning av förekomsten av neurodegenerativa proteinkonformationssjukdomar (PCD) har främjat ett stort intresse för detta ämne genom åren. Denna ökade uppmärksamhet har krävt diversifiering och förbättring av djurmodeller som kan reproducera sjukdomsfenotyper som observerats hos människor med PCD. Även om murina modeller har visat sig vara ovärderliga, är de dyra och är förknippade med mödosamma metoder med låg genomströmning. Användning av Caenorhabditis elegans nematodmodell för att studera PCD har motiverats av dess relativa enkla underhåll, låga kostnad och snabba generationstid, vilket möjliggör applikationer med hög genomströmning. Dessutom gör hög bevarande mellan C. elegans och mänskliga genom denna modell till ett ovärderligt upptäcktsverktyg. Nematoder som uttrycker fluorescerande taggade vävnadsspecifika polyglutamin (polyQ) -kanaler uppvisar ålders- och polyQ-längdberoende aggregering som kännetecknas av fluorescerande foci. Sådana reportrar används ofta som ombud för att övervaka förändringar i proteostas över vävnader. Manuell aggregerad kvantifiering är tidskrävande, vilket begränsar experimentell genomströmning. Dessutom kan manuell focikvantifiering införa bias, eftersom aggregerad identifiering kan vara mycket subjektiv. Häri standardiserades ett protokoll bestående av maskodling, bildförvärv och databehandling för att stödja aggregerad kvantifiering med hög genomströmning med C . elegans som uttrycker tarmspecifik polyQ. Genom att implementera en C. elegans-baserad bildbehandlingspipeline med CellProfiler, en bildanalysprogramvara, har denna metod optimerats för att separera och identifiera enskilda maskar och räkna upp deras respektive aggregat. Även om begreppet automatisering inte är helt unikt är behovet av att standardisera sådana procedurer för reproducerbarhet, eliminering av förspänning från manuell räkning och ökning av genomströmningen hög. Det förväntas att dessa metoder drastiskt kan förenkla screeningprocessen för stora bakterie-, genom- eller läkemedelsbibliotek med hjälp av C. elegans-modellen .
Åldersberoende neurodegenerativa proteinkonformationssjukdomar (PCD) såsom Alzheimers, Parkinsons och Huntingtons sjukdomar, eller amyotrofisk lateralskleros, kännetecknas av felveckning av protein som leder till aggregering, celldöd och vävnadsdegenerering1. Medan proteinfelveckning erkänns som den skyldige, är etiologin för dessa sjukdomar inte klar. Som sådan har utvecklingen av effektiva terapier hindrats av bristen på kunskap om de faktorer och tillstånd som bidrar till sjukdomsdebut och progression. Nya studier tyder på att förändringar i mikrobiomet påverkar uppkomsten, progressionen och svårighetsgraden av PCD 2,3,4. Komplexiteten hos det mänskliga, eller till och med murina, mikrobiomet gör det emellertid svårt att genomföra studier som skulle avslöja mikrobernas exakta inflytande på deras värd. Därför används enklare organismer, såsom Caenorhabditis elegans, ofta som ett upptäcktsverktyg 5,6,7,8. Nyligen genomförda studier har använt C. elegans för att undersöka effekten av bakterier på värdproteostas och sjukdomspatogenes 9,10. Bakteriell kolonisering, hormesis och genomiska förändringar är bland exemplifierande förhållanden som påverkar aggregeringen av polyglutamin (polyQ) kanaler 9,11,12. Dessutom uppvisar dessa felveckade proteinkluster polyQ-längd- och åldersberoende ackumulering inom värden och är associerade med nedsatt rörlighet 9,13. Det relativt enkla tillvägagångssättet att kvantifiera fluorescerande märkt puncta kan generera viktiga data om förhållanden, faktorer eller läkemedel som påverkar proteinveckning och aggregering.
Även om kvantifiering av fluorescerande puncta har visat sig vara ett tillförlitligt och relativt enkelt förfarande, återstår utmaningen att utveckla ett protokoll som skulle underlätta storskalig screening av föreningar, bakterier eller tillstånd som påverkar proteinaggregering. Konceptet automatiserad C. elegans bildbehandling och punctakvantifiering är inte helt nytt, eftersom ett antal praktiska stödverktyg har utvecklats14,15. Integrationen av odling, bildförvärv och en bearbetningspipeline är dock avgörande för att eliminera variationer i resultat och möjliggöra skärmar med högre genomströmning.
Som sådan är avsikten med detta manuskript att standardisera proceduren som används för att kvantifiera polyQ-aggregering i C. elegans som en proxy för att upptäcka förändringar i proteostas. Denna uppgift uppnåddes genom att använda CellProfiler, en programvara för bildanalys med öppen källkod16 som kan automatisera mask- och aggregatidentifiering, och är integrerad i ett större protokoll för odling av maskar, förvärv av bilder och bearbetning av data.
Det beskrivna protokollet beskriver procedurer för C. elegans odling, avbildning och bildbehandling som innehåller CellProfiler, en programvara för bildanalys med öppen källkod. De representativa resultaten visar reproducerbarhet, minskning av bias och skalbarhet. Detta standardiserade förfarande kommer att förbättra screeningstrategier som används med stora bakterie-, genom- eller läkemedelsbibliotek. Medan andra automatiserade C. elegans-metoder för objektdetektering finns, erbjuder den beskrivna tekniken en standardiserad pipeline med högre genomströmning som integrerar odling, bildförvärv och analys.
Flera varianter av maskodling måste testas för att optimera protokollet som beskrivs häri. Ursprungligen överfördes maskar till provbakterier omedelbart efter ålderssynkronisering (L1-steg). Ett sådant tillvägagångssätt resulterade emellertid i en population av maskar med varierande storlekar, även bland maskar inom samma brunn. C. elegans är kända för att undvikapatogener 19, vilket kan ha bidragit till den observerade variationen i storlek och i slutändan påverka nedströms avbildningsmaskdetektering, i synnerhet. För att eliminera sådan variation täcktes hela NGM-området i varje brunn med testbakterier. Dessutom utfodrades maskar med E. coli OP50 och tilläts utvecklas fullt ut till unga vuxna i 48 timmar vid 25 °C. Att låta maskar nå vuxen ålder på E. coli OP50 innan de överfördes till testbakterier resulterade i en mer konsekvent kroppsstorlek. Dessutom eliminerades överbeläggning och snabb matutarmning av avkomma genom att komplettera NGM-agar med FUDR. Implementeringen av FUDR tog bort avkomma och förbättrade automatiserad maskidentifiering, som doldes av avkomma som blandades med föräldrapopulationen. Det är dock viktigt att vara försiktig och använda lämpliga kontroller när du använder FUDR, eftersom föreningen är känd för att påverka C. elegans proteostas och livslängd20,21. Under de förhållanden som beskrivs i detta protokoll påverkade FUDR inte intestinal polyQ-aggregering (kompletterande figur 5); därför var dess användning lämplig och fördelaktig för den beskrivna metoden.
Frysning av prover före avbildning visade sig vara ett kritiskt steg i en framgångsrik anställning av rörledningen. Det sammanlagda antalet före frysningen var betydligt högre än det manuella antalet (figur 3B). Att hålla maskar vid -20 °C i 18-48 timmar före avbildning minskade bakgrundsfluorescensen och i slutändan förbättrade aggregatdetekteringen (figur 3A). Effekterna av frysning på aggregerad detektion har endast undersökts för polyQ och bör inte generaliseras till andra modeller utan ytterligare undersökning av sådana effekter.
Trots att alla förhållanden hölls desamma observerades att det genomsnittliga antalet aggregat per mask kunde variera mellan olika körningar, medan förhållandet mellan antalet aggregat hos djur som koloniserades med OP50 jämfört med MPAO1 förblev konsekvent (figur 6, kompletterande figur 2, kompletterande figur 5). Därför är det viktigt att alltid inkludera E. coli OP50-kontroll, eller eventuella ytterligare lämpliga referenskontroller, i varje körning. Sådan variation i aggregerat antal mellan experiment kan påverkas av miljöförhållanden (temperatur, fuktighet)22,23 eller genetisk bakgrund8. Faktum är att det observerades att efter långvarig odling minskade tarmfluorescensen drastiskt eller förlorades helt, vilket krävde upptining av en ny stam från fruset lager. Den observerade minskningen av fluorescens kan vara ett resultat av genetiska förändringar som undertrycker toxiska transgener, såsom de som uttrycker polyQ. Icke desto mindre betonar den exceptionella reproducerbarheten av de resultat som observerats mellan olika experimenter (kompletterande figur 2), mellan biologiska replikat (figur 5) och inom samma prov (kompletterande figur 3) styrkan i detta tillvägagångssätt.
Många rapporter har använt intestinal polyQ för att studera proteostas 9,11,12,13,24,25. En direkt jämförelse mellan resultat kan dock inte göras på grund av variation mellan experimentella tillvägagångssätt och avläsningsmetoder. Icke desto mindre rekapituleras några resultat från tidigare publicerade data av den automatiserade kvantifiering som beskrivs häri, inklusive bakteriell induktion av aggregering 9,13 och ett jämförbart antal aggregat11. Sammantaget erbjuder den beskrivna pipelinen ett värdefullt verktyg för att studera proteostas.
Metoden som beskrivs häri har vissa inneboende utmaningar. Det tar till exempel tillräckligt med tid för att behärska alla komponenter i detta protokoll, vilket särskilt gäller för avsnitt 8 i protokollet, vilket kräver förtrogenhet med analysen för att avgöra om de förvärvade bilderna är lämpliga för pipelineanalys. Avvikelser från de bildförvärvsinställningar som används i detta protokoll är möjliga; det kommer dock sannolikt att krävas ändring av inställningarna och maskträningsuppsättningen. Denna pipeline kan skilja aggregat av olika storlekar och de som berör, vilket begränsar “blandning” av aggregat och i slutändan ökar detekteringskänsligheten. Problem kan dock uppstå när du försöker identifiera stora aggregat som överskrider det accepterade storleksintervallet, eftersom utvidgning av den övre storlekströskeln kan leda till fel som orsakas av dålig identifiering, till exempel oförmågan att skilja aggregat som berör. En balans mellan noggrannhet, storlek och intensitet måste hittas före bildanalysen. Effektiviteten för aggregerad identifiering kan förbättras ytterligare genom att införliva maskininlärning för att skapa ett neuralt nätverk som kan förbättra aggregatdetektering. Sådana förbättringar undersöks för närvarande och kommer i hög grad att hjälpa till att ta itu med aktuella frågor som detektering av aggregat som ligger på olika fokalplan eller som har onormala former.
En anmärkningsvärd svaghet med den beskrivna metoden är variationen i automatiserade aggregaträkningar, eftersom de inte alltid rekapituleras av manuella räkningar i maskar som matas med olika bakteriestammar. Till exempel, baserat på automatiserade räkningar, hade maskar som matades med P. aeruginosa mutant 53 (M53) signifikant färre aggregat jämfört med vildtypsstammen (MPAO1) (figur 7); Bekräftelsen av träffen visade dock ingen signifikant skillnad (kompletterande figur 4). I allmänhet har läkemedelsskärmar med hög genomströmning en hög frekvens av falskt positiv träffdetektering, och den beskrivna metoden är inget undantag26. Således är det en kritisk del av protokollet att bekräfta alla potentiella träffar.
Medan detta protokoll optimerades för att passa en screeningstrategi för att identifiera bakterier som påverkar värdproteostas, kan varje steg modifieras ytterligare för att testa effekten av genomiska RNAi-bibliotek, små molekyler eller andra tillstånd. Ytterligare ändringar kan göras vid varje steg för att passa kraven i en specifik screeningstrategi. Dessutom ger denna teknik en nivå av flexibilitet som möjliggör optimering av varje steg för att passa en specifik modell. Till exempel kan detta tillvägagångssätt utvidgas till polyQ-aggregering i andra vävnader eller extrahera andra funktioner som detekteras i bilder, såsom övervakning av genuttryck med hjälp av inducerbara fluorescerande reportrar (t.ex. värmechockgener), bedömning av subcellulär lokalisering av proteiner (t.ex. kärnlokalisering av DAF-16), studier av aggregering i andra sjukdomsmodeller (Aβ1-42, α-synuklein, TDP-43, etc.) eller bedömning av fysiologiska fenotyper, såsom maskstorlek.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) och Infectious Diseases Society of America finansiering till DMC. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera eller förberedelse av manuskriptet. Vi tackar medlemmarna i Czyz Lab för korrekturläsning av manuskriptet. Tecknade figurer genererades med BioRender betald licens.
1.7 mL Microtubes | Olympus Plastics | Cat#24-282 | Microcentrifuge tubes |
10 mL Serological Pipettes | GenClone | Cat#12-104 | Plastic pipettes |
15 mL Centrifuge Tubes, Racked | Olympus Plastics | Cat#28-101 | Conical tubes |
5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Fisher Scientific | D2235100MG | FUDR |
Accu-jet Pro Pipette Controller | Genesee Scientific | 91-600RB | Pipette gun |
Agar | Fisher Scientific | Cat#BP1423-2 | Granulated agar |
BioRender | BioRender | Graphical figure generator | |
Bleach (Regular) | Clorox | Bar# 044600324111, Splash-less Bleach | 4.5% sodium hypochlorite |
C. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM140, Q35::YFP | Muscle polyQ |
C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p::q44::yfp; rol-6(su1006)] | Morimoto Lab (Northwestern University) | AM738, Q44::YFP | Intestinal polyQ |
CaCl2·2H2O | Fisher Scientific | Cat#C79-500 | Calcium chloride dihydrate |
CellProfiler | Broad Institute | Image analysis software | |
Cholesterol | Fisher Scientific | Cat#ICN10138201 | Cholesterol |
Circulating Water Bath Head | Lauda | 26LE | Lauda E 100 |
CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO | CoolLED | 8114931 | Fluorescent light control and emitter |
16 mL Culture Tubes | Olympus Plastics | 21-129 | Culture tubes, 17 mm x 100 mm |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | E. coli control strain |
Ethanol, 200 Proof | Decon Labs, Inc. | 2701 | |
Eyepiece 10x/23B, adjustable, 3d gen | Leica Microsystems | 10450910 | Eyepiece set |
Filter Set ET GFP – MZ10F | Leica Microsystems | 10450588 | Filter cube |
GraphPad Prism v9.2.0 | GraphPad Software, Inc. | Statistical analysis tool | |
Heratherm Incubator IMP180 | Thermo | 51031562 | Refrigerated incubator |
Innova 4000 | New Brunswick Scientific | M1192-0000 | Shaking incubator |
K5 Camera | Leica Microsystems | 11547112 | Stereomicroscope camera |
KH2P04 | Fisher Scientific | Cat#P285-3 | Potassium phosphate monobasic |
LAS X Imaging Software | Leica Microsystems | Microscope imaging software | |
Leica MZ10 F Optics Carrier | Leica Microsystems | 10450103 | Stereomicroscope |
Levamisole | Fisher Scientific | Cat#0215522805 | Levamisole hydrochloride |
Luria Broth (Lennox) | Apex Bioresearch Products | Cat#11-125 | LB |
Magnetic Stir Plate | Fisher Scientific | 11-100-49S | Stir plate |
MgSO4·7H2O | Alfa Aesar | A14491 | Magnesium sulfate heptahydrate |
Microscope Slides | Premiere | 8205 | Single frosted microscope slides |
Na2HPO4·7H2O | Fisher Scientific | Cat#S373-500 | Sodium phosphate dibasic heptahydrate |
NaCl | Fisher Scientific | Cat#S671-500 | Sodium chloride |
NaOH | Fisher Scientific | Cat#S318-3 | Sodium hydroxide pellets |
Objective Achromat, f = 100 mm | Leica Microsystems | 10411597 | Objective microscope lens |
Petri Dishes | Genesee Scientific | Cat#32-107G | 100 mm x 15 mm |
Pseudomonas aeruginosa Mutant Library | Manoil Lab (University of Washington) | P. aeruginosa mutant library | |
Suspension Culture Plate 24-Well, Flat Bottom | Olympus Plastics | 25-102 | Used for worm growth and imaging |
Trinocular Tube 100% M-series | Leica Microsystems | 10450043 | |
Trypticase Peptone | ThermoFisher, Difco | Cat#211921 | |
TX-400 Rotor | Thermo Scientific | Cat#75003181 | Swing bucket rotor |
Vacuum Driven Filter System | GenClone | Cat#25-227 | 500 mL, PES Membrane, .22 µm |
Video Objective with C-Mount | Leica Microsystems | 10447367 | 0.63x camera adapter tube |