CRISPR/Cas9 म्यूटाजेनेसिस के बाद इंडेल डिटेक्शन मच्छर एडीज एजिप्टी में उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघल विश्लेषण का उपयोग करके
Summary
यह लेख CRISPR / Cas9 द्वारा प्रेरित indels की तेजी से पहचान और उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघल विश्लेषण का उपयोग करके मच्छर एडीज एजिप्टी में उत्परिवर्ती लाइनों के चयन के लिए एक प्रोटोकॉल का विवरण देता है।
Abstract
मच्छर जीन संपादन कई प्रयोगशालाओं में प्रतिलेखन-उत्प्रेरक-जैसे प्रभावक न्यूक्लिएज (TALENs), जस्ता-उंगली न्यूक्लिएज (ZFNs), और होमिंग एंडोन्यूक्लिएज (एचई) जैसी प्रणालियों की स्थापना के साथ नियमित हो गया है। हाल ही में, clustered नियमित रूप से interspaced लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)/ CRISPR से जुड़े प्रोटीन 9 (Cas9) प्रौद्योगिकी परिशुद्धता जीनोम इंजीनियरिंग के लिए एक आसान और सस्ता विकल्प की पेशकश की है। न्यूक्लिएज कार्रवाई के बाद, डीएनए मरम्मत मार्ग टूटे हुए डीएनए सिरों को ठीक करेंगे, अक्सर इंडेल पेश करेंगे। इन आउट-ऑफ-फ्रेम म्यूटेशन का उपयोग तब लक्ष्य जीवों में जीन फ़ंक्शन को समझने के लिए किया जाता है। हालांकि, एक दोष यह है कि उत्परिवर्ती व्यक्तियों में कोई प्रमुख मार्कर नहीं होता है, जिससे उत्परिवर्ती एलील की पहचान और ट्रैकिंग चुनौतीपूर्ण हो जाती है, खासकर कई प्रयोगों के लिए आवश्यक तराजू पर।
उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघल विश्लेषण (एचआरएमए) न्यूक्लिक एसिड अनुक्रमों में भिन्नताओं की पहचान करने के लिए एक सरल विधि है और इस तरह की विविधताओं का पता लगाने के लिए पीसीआर पिघलने वाले वक्रों का उपयोग करता है। यह पोस्ट-पीसीआर विश्लेषण विधि इंस्ट्रूमेंटेशन के साथ फ्लोरोसेंट डबल-फंसे डीएनए-बाइंडिंग रंजक का उपयोग करती है जिसमें तापमान रैंप नियंत्रण डेटा कैप्चर क्षमता होती है और आसानी से 96-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूपों तक स्केल किया जाता है। यहाँ वर्णित एक सरल वर्कफ़्लो CRISPR / Cas9-प्रेरित indels की तेजी से पता लगाने और मच्छर Ae. aegypti में उत्परिवर्ती लाइनों की स्थापना के लिए HRMA का उपयोग कर रहा है। गंभीर रूप से, सभी चरणों को पैर के ऊतकों की एक छोटी मात्रा के साथ किया जा सकता है और जीव को बलिदान करने की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे आनुवंशिक क्रॉस या फेनोटाइपिंग एसेस को जीनोटाइपिंग के बाद किया जा सकता है।
Introduction
डेंगू 1, Zika2, और चिकनगुनिया 3 वायरस जैसे रोगजनकों के वैक्टर के रूप में, साथ ही मलेरिया परजीवी 4, मच्छर मनुष्यों के लिए एक महत्वपूर्ण सार्वजनिक स्वास्थ्य खतरे का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन सभी बीमारियों के लिए, मच्छर वैक्टर के नियंत्रण पर संचरण हस्तक्षेप का पर्याप्त ध्यान केंद्रित किया जाता है। उदाहरण के लिए, रोगजनकों, मच्छर फिटनेस, उत्तरजीविता, प्रजनन और कीटनाशकों के प्रतिरोध के लिए अनुमेयता में महत्वपूर्ण जीन का अध्ययन उपन्यास मच्छर नियंत्रण रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस तरह के उद्देश्यों के लिए, मच्छरों में जीनोम संपादन एक आम अभ्यास बन रहा है, विशेष रूप से एचई, जेडएफएन, टेलेन जैसी प्रौद्योगिकियों के विकास के साथ, और हाल ही में, कैस 9 के साथ CRISPR। जीन-संपादित उपभेदों की स्थापना में आमतौर पर कुछ पीढ़ियों के लिए वांछित उत्परिवर्तन ले जाने वाले बैकक्रॉसिंग व्यक्तियों को ऑफ-टारगेट और संस्थापक (बाधा) प्रभावों को कम करने के लिए शामिल किया जाता है, जिसके बाद विषमयुग्मजी व्यक्तियों को पार करने के लिए होमोजीगस या ट्रांस-विषमयुग्मजी रेखाएं उत्पन्न होती हैं। एक प्रमुख मार्कर की अनुपस्थिति में, इस प्रक्रिया में आणविक जीनोटाइपिंग आवश्यक है क्योंकि, कई मामलों में, विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती के लिए कोई स्पष्ट फेनोटाइपिक लक्षण नहीं पाया जा सकता है।
यद्यपि अनुक्रमण जीनोटाइपिक लक्षण वर्णन के लिए सोने का मानक है, सैकड़ों, या संभवतः हजारों व्यक्तियों में इसका प्रदर्शन करना, परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण लागत, श्रम और समय पैदा करता है, जो विशेष रूप से मच्छरों जैसे छोटे जीवनकाल वाले जीवों के लिए महत्वपूर्ण है। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले विकल्प सर्वेक्षक न्यूक्लिएज परख5 (एसएनए), T7E1 assay6, और उच्च संकल्प पिघल विश्लेषण (HRMA, in7 की समीक्षा) कर रहे हैं। SNA और T7E1 दोनों एंडोन्यूक्लिएज का उपयोग करते हैं जो केवल बेमेल आधारों को क्लीव करते हैं। जब विषमयुग्मजी उत्परिवर्ती जीनोम के उत्परिवर्तित क्षेत्र को प्रवर्धित किया जाता है, तो उत्परिवर्ती और जंगली-प्रकार के एलील से डीएनए टुकड़ों को बेमेल डबल-फंसे डीएनए (डीएसडीएनए) बनाने के लिए annealed किया जाता है। एसएनए एक बेमेल-विशिष्ट एंडोन्यूक्लिएज और सरल एगरोज जेल वैद्युतकणसंचलन के साथ पाचन के माध्यम से बेमेल की उपस्थिति का पता लगाता है। वैकल्पिक रूप से, HRMA dsDNA-बाइंडिंग फ्लोरोसेंट रंजक द्वारा पता लगाए गए dsDNA के थर्मोडायनामिक गुणों का उपयोग करता है, जिसमें डाई का विघटन तापमान उत्परिवर्तन की उपस्थिति और प्रकार के आधार पर भिन्न होता है। HRMA का उपयोग एकल-न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) 8, ज़ेबरा मछली 9 के उत्परिवर्ती जीनोटाइपिंग, सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुप्रयोग10, और पौधे आनुवंशिक अनुसंधान 11 का पता लगाने के लिए किया गया है।
यह पेपर एचआरएमए का वर्णन करता है, जो CRISPR / Cas9 तकनीक द्वारा उत्पन्न उत्परिवर्ती मच्छरों के लिए आणविक जीनोटाइपिंग की एक सरल विधि है। वैकल्पिक तकनीकों पर एचआरएमए के फायदों में 1) लचीलापन शामिल है, क्योंकि यह विभिन्न जीनों के लिए उपयोगी साबित हुआ है, इंडेल आकारों की एक विस्तृत श्रृंखला, साथ ही साथ विभिन्न इंडेल आकारों और विषमयुग्मजी, होमोजीगस और ट्रांस-विषमयुग्मजी भेदभाव 12,13,14, 2) लागत के बीच अंतर, क्योंकि यह आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले पीसीआर अभिकर्मकों पर आधारित है, और 3) समय की बचत, के रूप में यह सिर्फ कुछ ही घंटों में प्रदर्शन किया जा सकता है. इसके अलावा, प्रोटोकॉल डीएनए के स्रोत के रूप में एक छोटे से शरीर के हिस्से (एक पैर) का उपयोग करता है, जिससे मच्छर जीनोटाइपिंग प्रक्रिया से बच सकता है, जिससे उत्परिवर्ती लाइनों की स्थापना और रखरखाव की अनुमति मिलती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च-रिज़ॉल्यूशन पिघल विश्लेषण वेक्टर मच्छर Ae. aegypti में CRISPR / Cas9 तकनीक द्वारा उत्पन्न indels की पहचान के लिए एक सरल और तेज़ समाधान प्रदान करता है। यह लचीलापन प्रदान करता है, उड़ान की मांसपेशियों से लोहे के चय…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
सभी आंकड़े टेक्सास ए एंड एम विश्वविद्यालय के लाइसेंस के तहत Biorender.com के साथ बनाए गए थे। इस काम को एलर्जी और संक्रामक रोग के राष्ट्रीय संस्थान (AI137112 और AI115138 से Z.N.A.), टेक्सास ए एंड एम एग्रीलाइफ रिसर्च से कीट वेक्टरेड रोग अनुदान कार्यक्रम के तहत, और यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर, हैच प्रोजेक्ट 1018401 से धन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
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