Indel Detection efter CRISPR/Cas9 Mutagenese ved hjælp af høj opløsning Smelte Analyse i Mosquito Aedes aegypti
Summary
Denne artikel beskriver en protokol til hurtig identifikation af indels induceret af CRISPR / Cas9 og udvælgelse af mutant linjer i myg Aedes aegypti ved hjælp af høj opløsning smelte analyse.
Abstract
Myggegenredigering er blevet rutine i flere laboratorier med etablering af systemer som transskription-aktivator-lignende effektornukleaser (TALEN’er), zink-fingernukleaser (ZFN’er) og homing endonucleaser (HEs). For nylig har klynget regelmæssigt interspaced korte palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associeret protein 9 (Cas9) teknologi tilbudt et lettere og billigere alternativ til præcision genom engineering. Efter nuklease handling, DNA reparation veje vil fastsætte de brudte DNA-ender, ofte indføre indels. Disse out-of-frame mutationer bruges derefter til at forstå genfunktion i målorganismerne. En ulempe er imidlertid, at mutant individer bærer ingen dominerende markør, hvilket gør identifikation og sporing af mutant alleler udfordrende, især i skalaer, der er nødvendige for mange eksperimenter.
Høj opløsning smelteanalyse (HRMA) er en enkel metode til at identificere variationer i nukleinsyre sekvenser og udnytter PCR smeltekurver til at opdage sådanne variationer. Denne post-PCR analysemetode bruger fluorescerende dobbeltstrengede DNA-bindende farvestoffer med instrumentering, der har temperaturrampe kontrol datafangst kapacitet og er let skaleres til 96-brønd pladeformater. Beskrevet her er en simpel arbejdsgang ved hjælp af HRMA til hurtig påvisning af CRISPR / Cas9-inducerede indels og etablering af mutantlinjer i myggen Ae. aegypti. Kritisk, alle trin kan udføres med en lille mængde benvæv og kræver ikke at ofre organismen, så genetiske kors eller phenotyping assays, der skal udføres efter genotyping.
Introduction
Som vektorer af patogener som dengue1, Zika2 og chikungunya3-vira samt malariaparasitter4 udgør myg en betydelig trussel mod folkesundheden mod mennesker. For alle disse sygdomme er der et betydeligt fokus på transmissionsintervention på kontrol af mygvektorer. Undersøgelse af de gener, der er vigtige i for eksempel eftergivenhed over for patogener, mygfitfitness, overlevelse, reproduktion og resistens over for insekticider, er nøglen til udvikling af nye mygkontrolstrategier. Til sådanne formål er genomredigering i myg ved at blive en almindelig praksis, især med udviklingen af teknologier som HEs, ZFN’er, TALEN’er og senest CRISPR med Cas9. Etableringen af gen-redigerede stammer involverer typisk backcrossing personer, der bærer de ønskede mutationer i et par generationer for at minimere off-target og grundlægger (flaskehals) effekter, efterfulgt af at krydse heterozygote individer til at generere homozygot eller trans-heterozygot linjer. I mangel af en dominerende markør er molekylær genotyping nødvendig i denne proces, fordi der i mange tilfælde ikke kan påvises klare fænotypiske træk for heterozygote mutanter.
Selvom sekventering er guldstandarden for genotypisk karakterisering, udgør dette på tværs af hundreder, eller muligvis tusindvis af individer, betydelige omkostninger, arbejdskraft og tid, der kræves for at opnå resultater, hvilket er særligt kritisk for organismer med kort levetid som myg. Almindeligt anvendte alternativer er Surveyor nuclease assay5 (SNA), T7E1 assay6, og høj opløsning smelte analyse (HRMA, gennemgået in7). Både SNA og T7E1 bruger endonucleaser, der kun spalter uoverensstemmende baser. Når en muteret region af det heterozygode mutantgenom forstærkes, forstærkes DNA-fragmenter fra mutante og vilde alleler for at lave uoverensstemmende dobbeltstrenget DNA (dsDNA). SNA registrerer tilstedeværelsen af uoverensstemmelser via fordøjelsen med en mismatch-specifik endonuclease og simpel agarose gel elektroforese. Alternativt bruger HRMA de termodynamiske egenskaber af dsDNA opdaget af dsDNA-bindende fluorescerende farvestoffer, med disassociation temperaturen af farvestoffet varierende baseret på tilstedeværelsen og typen af mutation. HRMA er blevet brugt til påvisning af enkelt-nukleotidpolymorfier (SNPs)8, mutant genotyping af zebrafisk9, mikrobiologiske anvendelser10 og plantegenetisk forskning11, blandt andre.
Dette papir beskriver HRMA, en simpel metode til molekylær genotyping for mutant myg genereret af CRISPR / Cas9 teknologi. Fordelene ved HRMA frem for alternative teknikker omfatter 1) fleksibilitet, da det har vist sig nyttigt for forskellige gener, en bred vifte af indel størrelser, samt sondringen mellem forskellige indel størrelser og heterozygot, homozygot, og trans-heterozygot differentiering12,13,14, 2) omkostninger, da det er baseret på almindeligt anvendte PCR reagenser, og 3) tidsbesparende, som det kan udføres på blot et par timer. Derudover bruger protokollen en lille kropsdel (et ben) som en kilde til DNA, så myggen kan overleve genotypingprocessen, hvilket tillader etablering og vedligeholdelse af mutantlinjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Smelteanalyse med høj opløsning tilbyder en enkel og hurtig løsning til identifikation af indels genereret af CRISPR/Cas9-teknologi i vektormyggen Ae. aegypti. Det giver fleksibilitet, der muliggør genotyping af myg muteret for en bred vifte af gener fra flyvemuskel til jernmetabolisme og mere13,14. HRMA kan udføres på få timer fra prøvesamling til de endelige analyser. Ekstra tid er nødvendig for primer design og vil også afhænge af den tid t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alle tal blev skabt med Biorender.com under en licens til Texas A &M University. Dette arbejde blev støttet af midler fra National Institute of Allergy and Infectious Disease (AI137112 og AI115138 til Z.N.A.), Texas A &M AgriLife Research under Insect Vectored Disease Grant Program og USDA National Institute of Food and Agriculture, Hatch-projektet 1018401.
Materials
| 70% Ethanol | 70% ethanol solution in water | ||
| 96-well PCR and Real-time PCR plates | VWR | 82006-636 | For obtaining genomic DNA (from the mosquito leg) |
| 96-well plate templates | House-made printed, for genotype recording | ||
| Bio Rad CFX96 | Bio Rad | PCR machine with gradient and HRMA capabilities | |
| Diversified Biotech reagent reservoirs | VWR | 490006-896 | |
| Exo-CIP Rapid PCR Cleanup Kit | New England Biolabs | E1050S | |
| Glass Petri Dish | VWR | 89001-246 | 150 mm x 20 mm |
| Hard-shell thin-wall 96-well skirted PCR plates | Bio-rad | HSP9665 | For HRMA |
| Multi-channel pipettor (P10) | Integra Biosciences | 4721 | |
| Multi-channel pipettor (P300) | Integra Biosciences | 4723 | |
| Nunc Polyolefin Acrylate Sealing tape, Thermo Scientific | VWR | 37000-548 | To use with the 96-well PCR plates for obtaining genomic DNA |
| Optical sealing tape | Bio-rad | 2239444 | To use with the 96-well skirted PCR plates for HRMA |
| Phire Animal tissue direct PCR Kit (without sampling tools) | Thermo Fisher | F140WH | For obtaining genomic DNA and performing PCR |
| Plastic Fly Vial Dividers | Genesee | 59-128W | |
| Precision Melt Analysis Software | Bio Rad | 1845025 | Used for genotyping the mosquito DNA samples and analyzing the thermal denaturation properties of double-stranded DNA (see protocol step 3.3) |
| SeqMan Pro | DNAstar Lasergene software | For multiple sequence alignment | |
| Single-channel pipettor | Gilson | ||
| Tweezers Dumont #5 11 cm | WPI | 14098 | |
| White foam plugs | VWR | 60882-189 | |
| Wide Drosophila Vials, Polystyrene | Genesee | 32-117 | |
| Wide Fly Vial Tray, Blue | Genesee | 59-164B |
References
- WHO. Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control. WHO. , 160 (2009).
- WHO. Zika epidemiology update. WHO. , 1-13 (2019).
- WHO. Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever. WHO. , (2009).
- World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791 (2020)
- Qiu, P., et al. Mutation detection using Surveyor nuclease. Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).
- Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection. Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).
- Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. High resolution melting applications for clinical laboratory medicine. Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).
- Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).
- Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants. Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).
- Tong, S. Y., Giffard, P. M. Microbiological applications of high-resolution melting analysis. Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).
- Simko, I. High-resolution DNA melting analysis in plant research. Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).
- Basu, S., et al. Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).
- O’Leary, S., Adelman, Z. N. CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971 (2020).
- Kojin, B. B., et al. Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands. Malaria Journal. 20 (1), 11 (2021).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Larkin, M. A., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).
- Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment. Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).
- Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).
- Zuker, M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).
- Hill, J. T., et al. Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products. Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).
- Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti. Frontiers in Physiology. 9, 380 (2018).
- Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316 (2017).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
