आसंजन पदचिह्न परख द्वारा सेल रोलिंग में इमेजिंग आणविक आसंजन
Summary
इस प्रोटोकॉल तेजी से सेल रोलिंग आसंजन के दौरान आसंजन घटनाओं की छवि के लिए आसंजन पदचिह्न परख प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रस्तुत करता है।
Abstract
रोलिंग आसंजन, selectin-मध्यस्थता इंटरैक्शन द्वारा सुविधाजनक, सूजन की साइट के लिए ल्यूकोसाइट्स की भर्ती में एक अत्यधिक गतिशील, निष्क्रिय गतिशीलता है। यह घटना पोस्टकेशिका वेन्यूल्स में होती है, जहां रक्त प्रवाह एंडोथेलियल कोशिकाओं पर एक रोलिंग गति में ल्यूकोसाइट्स को धक्का देता है। स्थिर रोलिंग के लिए आसंजन बंधन गठन और उनके यांत्रिक रूप से संचालित पृथक्करण के बीच एक नाजुक संतुलन की आवश्यकता होती है, जिससे सेल को प्रवाह की दिशा में रोल करते समय सतह से जुड़ा रहने की अनुमति मिलती है। अपेक्षाकृत स्थिर वातावरण में होने वाली अन्य आसंजन प्रक्रियाओं के विपरीत, रोलिंग आसंजन अत्यधिक गतिशील है क्योंकि रोलिंग कोशिकाएं प्रति सेकंड दसियों माइक्रोन पर हजारों माइक्रोन पर यात्रा करती हैं। नतीजतन, पारंपरिक मेकानोबायोलॉजी विधियां जैसे कि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी व्यक्तिगत आसंजन घटनाओं और संबंधित आणविक बलों को मापने के लिए अनुपयुक्त हैं, जो कम समय के पैमाने और उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता के कारण हैं। यहां, हम आसंजन पदचिह्न परख के हमारे नवीनतम कार्यान्वयन का वर्णन करने के लिए पी-selectin छवि: PSGL-1 आणविक स्तर पर रोलिंग आसंजन में बातचीत. यह विधि प्रतिदीप्ति पटरियों के रूप में आणविक आसंजन घटनाओं के स्थायी इतिहास का उत्पादन करने के लिए अपरिवर्तनीय डीएनए-आधारित तनाव गेज टेथर का उपयोग करती है। इन पटरियों को दो तरीकों से चित्रित किया जा सकता है: (1) दृश्य के एक बड़े क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए हजारों विवर्तन-सीमित छवियों को एक साथ सिलाई करना, लंबाई में हजारों माइक्रोन पर प्रत्येक रोलिंग सेल के आसंजन पदचिह्न के निष्कर्षण को सक्षम करना, (2) डीएनए-पेंट का प्रदर्शन देखने के एक छोटे से क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति पटरियों की सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों का पुनर्निर्माण करने के लिए। इस अध्ययन में, आसंजन पदचिह्न परख का उपयोग एचएल -60 कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया था जो विभिन्न कतरनी तनावों पर रोलिंग करते हैं। ऐसा करने में, हम पी-सेलेक्टिन के स्थानिक वितरण की छवि बनाने में सक्षम थे: पीएसजीएल -1 इंटरैक्शन और प्रतिदीप्ति तीव्रता के माध्यम से उनके आणविक बलों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करें। इस प्रकार, यह विधि आणविक स्तर पर रोलिंग आसंजन में शामिल विभिन्न सेल-सतह इंटरैक्शन की मात्रात्मक जांच के लिए आधार प्रदान करती है।
Introduction
रोलिंग आसंजन कैस्केड का वर्णन करता है कि रक्त वाहिका wall1 के साथ कोशिकाओं को टेदर और रोल करने के लिए कैसे परिसंचारी। निष्क्रिय रोलिंग मुख्य रूप से selectins, सेलुलर आसंजन अणुओं (CAMs) का एक प्रमुख वर्ग द्वारा मध्यस्थता की जाती है। रक्त के कतरनी प्रवाह के तहत, पी-सेलेक्टिन ग्लाइकोप्रोटीन लिगैंड -1 (पीएसजीएल -1) को व्यक्त करने वाले ल्यूकोसाइट्स पी-सेलेक्टिन के साथ अत्यधिक क्षणिक बंधन बनाते हैं, जिसे सूजन एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किया जा सकता है। यह प्रक्रिया ल्यूकोसाइट्स के लिए सूजन की साइट पर माइग्रेट करने के लिए महत्वपूर्ण है2। इसके अलावा, PSGL-1 भी एक mechanosensitive रिसेप्टर P-selectin3 के साथ अपनी सगाई पर रोलिंग आसंजन कैस्केड के बाद के फर्म आसंजन चरण को ट्रिगर करने में सक्षम है।
सीएएम फ़ंक्शन को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन प्रतिरक्षा प्रणाली को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि ल्यूकोसाइट आसंजन की कमी (एलएडी) की दुर्लभ बीमारी में, जहां रोलिंग की मध्यस्थता करने वाले आसंजन अणुओं की खराबी गंभीर रूप से इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों की ओर ले जाती है4,5,6। इसके अलावा, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं को एक समान रोलिंग प्रक्रिया के बाद माइग्रेट करने के लिए दिखाया गया है, जिससे मेटास्टेसिस 7,8 हो जाता है। हालांकि, क्योंकि सेल रोलिंग तेज और गतिशील है, पारंपरिक प्रयोगात्मक mechanobiology विधियां सेल रोलिंग के दौरान आणविक इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हैं। जबकि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल चिमटी जैसे एकल-सेल और एकल-अणु हेरफेर विधियां एकल-अणु स्तर 9 पर पीएसजीएल -1 के साथ पी-सेलेक्टिन की बल-निर्भर बातचीत जैसे आणविक इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम थीं, वे सेल रोलिंग के दौरान लाइव आसंजन घटनाओं की जांच के लिए अनुपयुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, विट्रो में विशेषता वाली बातचीत सीधे विवो में आणविक आसंजन के बारे में सवाल का जवाब नहीं दे सकती है। उदाहरण के लिए, जब कोशिकाएं अपने मूल वातावरण में काम कर रही हैं तो कौन सी आणविक तनाव सीमा जैविक रूप से प्रासंगिक है? कम्प्यूटेशनल विधियों जैसे चिपकने वाली गतिशीलता सिमुलेशन 10 या सरल स्थिर-राज्य मॉडल 11 ने कुछ आणविक विवरणों पर कब्जा कर लिया है और वे रोलिंग व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं लेकिन मॉडलिंग पैरामीटर और मान्यताओं की सटीकता पर अत्यधिक निर्भर हैं। अन्य तकनीकें जैसे कर्षण बल माइक्रोस्कोपी सेल माइग्रेशन के दौरान बलों का पता लगा सकती हैं लेकिन आणविक तनाव पर पर्याप्त स्थानिक संकल्प या मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करती हैं। इन तकनीकों में से कोई भी अस्थायी गतिशीलता, स्थानिक वितरण, और आणविक बलों की परिमाण विषमता के प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक अवलोकन प्रदान नहीं कर सकता है, जो सीधे अपने मूल वातावरण में सेल फ़ंक्शन और व्यवहार से संबंधित हैं।
इसलिए, एक आणविक बल सेंसर को लागू करना जो चयन-मध्यस्थता इंटरैक्शन को सटीक रूप से मापने में सक्षम है, रोलिंग आसंजन की हमारी समझ में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम आसंजन पदचिह्न परख 12 के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जहां पीएसजीएल -1 लेपित मोतियों को पी-सेलेक्टिन कार्यात्मक तनाव गेज टेथर (टीजीटी) 13 प्रस्तुत करने वाली सतह पर लुढ़काया जाता है। ये टीजीटी अपरिवर्तनीय डीएनए-आधारित बल सेंसर हैं जिनके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति रीडआउट के रूप में टूटने की घटनाओं का स्थायी इतिहास होता है। यह टीजीटी (dsDNA) के rupturing के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और फिर एक फ्लोरोसेंटली लेबल पूरक स्ट्रैंड के साथ टूट टीजीटी (ssDNA) के बाद लेबलिंग। इस प्रणाली का एक प्रमुख लाभ विवर्तन-सीमित और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग दोनों के साथ इसकी संगतता है। फ्लोरोसेंटली लेबल पूरक स्ट्रैंड को या तो विवर्तन-सीमित इमेजिंग के लिए स्थायी रूप से बाध्य (>12 बीपी) या डीएनए पेंट के माध्यम से सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए क्षणिक रूप से बाध्य (7-9 बीपी) किया जा सकता है। रोलिंग आसंजन का अध्ययन करने के लिए यह एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि सक्रिय रोलिंग के दौरान टीजीटी टूट जाते हैं, लेकिन प्रतिदीप्ति रीडआउट का विश्लेषण पोस्ट-रोलिंग के बाद किया जाता है। दो इमेजिंग विधियां उपयोगकर्ता को रोलिंग आसंजन की जांच करने के लिए अधिक स्वतंत्रता भी प्रदान करती हैं। आमतौर पर, विवर्तन-सीमित इमेजिंग प्रतिदीप्ति तीव्रता 13 के माध्यम से आणविक टूटना बल निकालने के लिए उपयोगी है, जबकि सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग रिसेप्टर घनत्व के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। रोलिंग आसंजन के इन गुणों की जांच करने की क्षमता के साथ, यह दृष्टिकोण कतरनी प्रवाह के तहत रोलिंग कोशिकाओं के आणविक आसंजन पर बल-विनियमन तंत्र को समझने के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आसंजन पदचिह्न परख सेल रोलिंग आसंजन के दौरान PSGL-1 और पी-selectin के बीच आणविक आसंजन घटनाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। इस प्रक्रिया को पी-सेलेक्टिन-मध्यस्थता कैप्चरिंग द्वारा शुरू किया जाता है, जिसके बाद तरल प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को कनाडा फाउंडेशन ऑफ इनोवेशन (सीएफआई 35492), कनाडा डिस्कवरी ग्रांट के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (आरजीपीआईएन-2017-04407), रिसर्च फंड में नई सीमाएं (NFRFE-2018-00969), माइकल स्मिथ फाउंडेशन फॉर हेल्थ रिसर्च (SCH-2020-0559), और ब्रिटिश कोलंबिया एमिनेंस फंड विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
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