Визуализация молекулярной адгезии в клеточной прокатке с помощью анализа адгезионного следа
Summary
В этом протоколе представлены экспериментальные процедуры для выполнения анализа адгезионного следа для изображения событий адгезии во время быстрой клеточной скользящей адгезии.
Abstract
Скользящая адгезия, облегчаемая селектин-опосредованными взаимодействиями, представляет собой высокодинамичную, пассивную подвижность при наборе лейкоцитов к месту воспаления. Это явление происходит в посткапиллярных венулах, где кровоток толкает лейкоциты в скользящем движении по эндотелиальным клеткам. Стабильная прокатка требует тонкого баланса между образованием адгезионных связей и их механически управляемой диссоциацией, что позволяет ячейке оставаться прикрепленной к поверхности во время прокатки в направлении потока. В отличие от других процессов адгезии, происходящих в относительно статических средах, адгезия качения очень динамична, поскольку клетки качения перемещаются на тысячи микрон со скоростью десятки микрон в секунду. Следовательно, обычные методы механобиологии, такие как микроскопия силы тяги, непригодны для измерения отдельных событий адгезии и связанных с ними молекулярных сил из-за короткой временной шкалы и требуемой высокой чувствительности. Здесь мы описываем нашу последнюю реализацию анализа адгезионного следа для изображения P-селектина: взаимодействия PSGL-1 в адгезии качения на молекулярном уровне. Этот метод использует необратимые тросы натяжения на основе ДНК для получения постоянной истории событий молекулярной адгезии в виде флуоресцентных дорожек. Эти дорожки могут быть изображены двумя способами: (1) сшивание тысяч изображений с дифракционным ограничением для создания большого поля зрения, что позволяет извлекать адгезионный след каждой скользящей клетки длиной более тысяч микрон, (2) выполнение DNA-PAINT для реконструкции изображений со сверхвысоким разрешением флуоресцентных дорожек в небольшом поле зрения. В этом исследовании анализ адгезионного следа использовался для изучения клеток HL-60, катящихся при различных напряжениях сдвига. При этом мы смогли изобразить пространственное распределение взаимодействия P-селектина: PSGL-1 и получить представление об их молекулярных силах через интенсивность флуоресценции. Таким образом, этот метод обеспечивает основу для количественного исследования различных взаимодействий между клеткой и поверхностью, участвующих в адгезии качения на молекулярном уровне.
Introduction
Каскад скользящей адгезии описывает, как циркулирующие клетки привязываются к стенке кровеносного сосуда и катятся вдоль нее1. Пассивная прокатка в основном опосредована селектинами, основным классом молекул клеточной адгезии (CAMs)1. Под сдвиговым потоком крови лейкоциты, экспрессирующие Р-селектин гликопротеин лиганд-1 (PSGL-1), образуют высокопреходящие связи с Р-селектином, которые могут экспрессироваться на поверхности воспаленных эндотелиальных клеток. Этот процесс имеет решающее значение для того, чтобы лейкоциты мигрировали в место воспаления2. Кроме того, PSGL-1 также является механочувствительным рецептором, способным запускать последующую стадию твердой адгезии каскада скользящей адгезии при его взаимодействии с P-селектином3.
Генетические мутации, влияющие на функцию CAM, могут серьезно повлиять на иммунную систему, например, при редком заболевании дефицита адгезии лейкоцитов (LAD), где нарушение адгезии молекул, опосредующих прокатку, приводит к сильному ослаблению иммунитета лиц4,5,6. Кроме того, было показано, что циркулирующие опухолевые клетки мигрируют после аналогичного процесса прокатки, что приводит к метастазированию7,8. Однако, поскольку клеточная прокатка является быстрой и динамичной, обычные экспериментальные методы механобиологии непригодны для изучения молекулярных взаимодействий во время клеточной прокатки. В то время как одноклеточные и одномолекулярные методы манипулирования, такие как атомно-силовая микроскопия и оптический пинцет, смогли изучить молекулярные взаимодействия, такие как силово-зависимое взаимодействие P-селектина с PSGL-1 на уровне одной молекулы9, они непригодны для исследования событий живой адгезии во время клеточного качения. Кроме того, взаимодействие, характеризуемое in vitro, не может напрямую ответить на вопрос о молекулярной адгезии in vivo. Например, какой диапазон молекулярного напряжения является биологически значимым, когда клетки функционируют в своей родной среде? Вычислительные методы, такие как моделирование адгезионной динамики10 или простая стационарная модель11, охватывают определенные молекулярные детали и то, как они влияют на поведение качения, но сильно зависят от точности параметров моделирования и предположений. Другие методы, такие как микроскопия силы тяги, могут обнаруживать силы во время миграции клеток, но не обеспечивают достаточного пространственного разрешения или количественной информации о молекулярном напряжении. Ни один из этих методов не может обеспечить прямые экспериментальные наблюдения за временной динамикой, пространственным распределением и неоднородностью величин молекулярных сил, которые напрямую связаны с функцией и поведением клеток в их родной среде.
Поэтому внедрение датчика молекулярной силы, способного точно измерять селектин-опосредованные взаимодействия, имеет решающее значение для улучшения нашего понимания адгезии при качении. Здесь мы описываем протокол анализа адгезионного следа12, где шарики с покрытием PSGL-1 катаются на поверхности, представляющей п-селектин функционализированные тросы датчика напряжения (TGTs)13. Эти ТГТ являются необратимыми датчиками силы на основе ДНК, которые приводят к постоянной истории событий разрыва в виде считывания флуоресценции. Это достигается путем разрыва TGT (dsDNA) и последующей маркировки разорванной TGT (ssDNA) флуоресцентно меченой дополнительной нитью. Одним из основных преимуществ этой системы является ее совместимость как с дифракционными ограничениями, так и с изображениями со сверхвысоким разрешением. Флуоресцентно меченая комплементарная нить может быть либо постоянно связанной (>12 bp) для дифракционно-ограниченной визуализации, либо временно связанной (7-9 bp) для визуализации сверхвысокого разрешения через DNA PAINT. Это идеальная система для изучения адгезии при качении, поскольку ТГТ разрываются во время активной прокатки, но показания флуоресценции анализируются после прокатки. Два метода визуализации также предоставляют пользователю больше свободы для исследования адгезии при качении. Как правило, дифракционно-ограниченная визуализация полезна для извлечения силы молекулярного разрыва через интенсивность флуоресценции13, тогда как визуализация со сверхвысоким разрешением позволяет проводить количественный анализ плотности рецепторов. Благодаря возможности исследования этих свойств адгезии качения этот подход обеспечивает перспективную платформу для понимания механизма силовой регуляции молекулярной адгезии клеток качения при сдвиговом потоке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ адгезионного следа позволяет визуализировать события молекулярной адгезии между PSGL-1 и P-селектином во время клеточной скользящей адгезии. Этот процесс инициируется P-селектин-опосредованным захватом с последующей прокаткой под текучим напряжением сдвига. Потенциальные пробл?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Канадским фондом инноваций (CFI 35492), Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), Фондом новых рубежей в исследованиях (NFRFE-2018-00969), Фондом Майкла Смита для исследований в области здравоохранения (SCH-2020-0559) и Фондом возвышения Университета Британской Колумбии.
Materials
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules – Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
