Imagerie de l’adhésion moléculaire dans le laminage cellulaire par essai d’empreinte d’adhérence

Summary

Ce protocole présente les procédures expérimentales pour effectuer le test d’empreinte d’adhérence afin d’imager les événements d’adhérence pendant l’adhésion rapide des cellules.

Abstract

L’adhésion roulante, facilitée par des interactions médiées par la sélection, est une motilité passive très dynamique dans le recrutement des leucocytes sur le site de l’inflammation. Ce phénomène se produit dans les veinules postcapillaires, où le flux sanguin pousse les leucocytes dans un mouvement roulant sur les cellules endothéliales. Un laminage stable nécessite un équilibre délicat entre la formation de liaisons d’adhérence et leur dissociation mécanique, permettant à la cellule de rester attachée à la surface tout en roulant dans le sens de l’écoulement. Contrairement à d’autres processus d’adhérence se produisant dans des environnements relativement statiques, l’adhérence au roulement est très dynamique car les cellules de laminage se déplacent sur des milliers de microns à des dizaines de microns par seconde. Par conséquent, les méthodes de mécanobiologie conventionnelles telles que la microscopie à force de traction ne conviennent pas à la mesure des événements d’adhésion individuels et des forces moléculaires associées en raison de la courte échelle de temps et de la sensibilité élevée requises. Ici, nous décrivons notre dernière implémentation du test d’empreinte d’adhérence pour imager les interactions P-selectin: PSGL-1 dans l’adhésion laminée au niveau moléculaire. Cette méthode utilise des attaches de jauge de tension irréversibles à base d’ADN pour produire un historique permanent des événements d’adhésion moléculaire sous la forme de pistes de fluorescence. Ces pistes peuvent être imagées de deux manières: (1) assembler des milliers d’images limitées par diffraction pour produire un grand champ de vision, permettant l’extraction de l’empreinte d’adhérence de chaque cellule roulante sur des milliers de microns de longueur, (2) effectuer DNA-PAINT pour reconstruire des images super-résolution des pistes de fluorescence dans un petit champ de vision. Dans cette étude, le test d’empreinte d’adhérence a été utilisé pour étudier les cellules HL-60 roulant à différentes contraintes de cisaillement. Ce faisant, nous avons pu imager la distribution spatiale de l’interaction P-selectin: PSGL-1 et mieux comprendre leurs forces moléculaires grâce à l’intensité de la fluorescence. Ainsi, cette méthode fournit les bases de l’étude quantitative des différentes interactions cellule-surface impliquées dans l’adhésion au roulement au niveau moléculaire.

Introduction

La cascade d’adhésion roulante décrit comment les cellules circulantes s’attachent et roulent le long de la paroi des vaisseaux ^sanguins1. Le laminage passif est principalement médié par les sélectines, une classe majeure de molécules d’adhésion cellulaire (MCA)¹. Sous le flux de cisaillement du sang, les leucocytes exprimant le ligand 1 de la glycoprotéine P-sélectine (PSGL-1) forment des liaisons hautement transitoires avec la P-sélectine, qui peuvent être exprimées à la surface des cellules endothéliales enflammées. Ce processus est essentiel pour que les leucocytes migrent vers un site d’inflammation2. En outre, PSGL-1 est également un récepteur mécanosensible capable de déclencher l’étape d’adhésion ferme ultérieure de la cascade d’adhésion roulante lors de son engagement avec P-selectin3.

Les mutations génétiques affectant la fonction CAM peuvent affecter gravement le système immunitaire, comme dans la maladie rare du déficit en adhésion leucocytaire (LAD), où le dysfonctionnement des molécules d’adhésion médiant le roulement conduit à des individus gravement immunodéprimés4,5,6. En outre, il a été démontré que les cellules tumorales circulantes migrent à la suite d’un processus de roulement similaire, conduisant à des métastases7,8. Cependant, parce que le laminage cellulaire est rapide et dynamique, les méthodes expérimentales conventionnelles de mécanobiologie ne conviennent pas à l’étude des interactions moléculaires pendant le laminage cellulaire. Bien que les méthodes de manipulation à cellule unique et à molécule unique telles que la microscopie à force atomique et la pince optique aient pu étudier les interactions moléculaires telles que l’interaction dépendante de la force de la P-sélectine avec PSGL-1 au niveau de la molécule ^unique9, elles ne conviennent pas à l’étude des événements d’adhésion en direct pendant le roulement cellulaire. De plus, l’interaction caractérisée in vitro ne peut pas répondre directement à la question de l’adhésion moléculaire in vivo. Par exemple, quelle plage de tension moléculaire est biologiquement pertinente lorsque les cellules fonctionnent dans leur environnement natif? Les méthodes de calcul telles que la simulation de la dynamique des ^adhésifs10 ou le modèle simple à l’état d’équilibre11 ont capturé certains détails moléculaires et leur influence sur le comportement de roulement, mais dépendent fortement de la précision des paramètres et des hypothèses de modélisation. D’autres techniques telles que la microscopie à force de traction peuvent détecter les forces lors de la migration cellulaire, mais ne fournissent pas une résolution spatiale suffisante ou des informations quantitatives sur la tension moléculaire. Aucune de ces techniques ne peut fournir d’observations expérimentales directes de la dynamique temporelle, de la distribution spatiale et de l’hétérogénéité de magnitude des forces moléculaires, qui sont directement liées à la fonction et au comportement des cellules dans leur environnement natif.

Par conséquent, la mise en œuvre d’un capteur de force moléculaire capable de mesurer avec précision les interactions médiées par la sélection est cruciale pour améliorer notre compréhension de l’adhérence au roulement. Nous décrivons ici le protocole pour le test d’empreinte ^{d’adhérence12} où des billes revêtues de PSGL-1 sont roulées sur une surface présentant des attaches de jauge de tension fonctionnalisées p-selectin (TGT)¹³. Ces TGT sont des capteurs de force irréversibles basés sur l’ADN qui entraînent un historique permanent des événements de rupture sous forme de lecture de fluorescence. Ceci est réalisé par la rupture du TGT (dsDNA), puis le marquage ultérieur du TGT rompu (ssDNA) avec un brin complémentaire marqué par fluorescence. L’un des principaux avantages de ce système est sa compatibilité avec l’imagerie à diffraction limitée et l’imagerie à super résolution. Le brin complémentaire marqué par fluorescence peut être lié de manière permanente (>12 pb) pour l’imagerie à diffraction limitée ou transitoirement lié (7-9 pb) pour l’imagerie à super-résolution par DNA PAINT. Il s’agit d’un système idéal pour étudier l’adhérence au laminage car les TGT sont rompus pendant le laminage actif, mais la lecture de fluorescence est analysée après le laminage. Les deux méthodes d’imagerie offrent également à l’utilisateur plus de liberté pour étudier l’adhérence au roulement. En règle générale, l’imagerie à diffraction limitée est utile pour extraire la force de rupture moléculaire par l’intensité de ^{fluorescence13}, tandis que l’imagerie à super-résolution permet une analyse quantitative de la densité des récepteurs. Avec la capacité d’étudier ces propriétés d’adhérence au laminage, cette approche fournit une plate-forme prometteuse pour comprendre le mécanisme de régulation de la force sur l’adhésion moléculaire des cellules de laminage sous écoulement de cisaillement.

Protocol

1. Marquage et hybridation des oligonucléotides Réduction des liaisons disulfure de protéine G Dissoudre 10 mg de protéine G (ProtG) dans 1 mL d’eau ultrapure.REMARQUE: La protéine G ici est modifiée avec un seul résidu de cystéine à l’extrémité C et une étiquette poly-histidine N-terminus. Échange tampon ≥20 μL de ProtG (10 mg/mL) en 1x PBS (pH 7,2) avec une colonne P6. Mesurer la concentration en protéines après échange de tampon.RE…

Representative Results

Le protocole ci-dessus décrit la procédure expérimentale du test d’empreinte d’adhérence. Le flux de travail général de l’expérience est illustré à la Figure 1, de l’assemblage de la chambre d’écoulement (Figure 1A) à la fonctionnalisation de surface (Figure 1B) et aux étapes d’expérimentation et d’imagerie (Figure 1C). La figur…

Discussion

Le test d’empreinte d’adhérence permet de visualiser les événements d’adhésion moléculaire entre PSGL-1 et P-selectin pendant l’adhésion au roulement cellulaire. Ce processus est initié par la capture médiée par la sélection P suivie d’un laminage sous contrainte de cisaillement fluidique. Les problèmes potentiels au cours de l’expérience impliquent généralement un mauvais roulement cellulaire ou des pistes fluorescentes manquantes, même lorsque les cellules roulent bien. Ces problèmes résult…

Materials

4-channel drill guide	Custom made		3D printed with ABS filament
4-holes slide	Custom made		Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone	VWR	BDH1101-4LP
Acrylic spacer	Custom made		Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder	Custom made		Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution	Cytiva HyClone	SV3007901	Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene	Spherotech	PGP-60-5
Bovine serum albumin	VWR	332
Buffer, DNA PAINT			0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5			10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling			HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride	VWR	BDH9224
Cell culture flasks	VWR	10062-868
Concentrated sulfuric acid	VWR	BDH3072-2.5LG	95-98%
Coverslip holding tweezers	Techni-Tool	758TW150
Diamond-coated drill bits	Abrasive technology	C5250510	0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)	IDT DNA	Custom oligo	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT	IDT DNA	Custom oligo	GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape	Scotch	237	3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA	Thermofisher	15575020	0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy	Gorilla	42001	5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
Glacial acetic acid	VWR	BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
Glass, Microscope slide	VWR	48300-026	75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar	VWR	74830-150	Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)	Lonza	04-315Q
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
Humidity chamber slide support	Custom made		3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide	VWR	BDH7690-1	30%
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Inlets/outlets	Custom made		Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	Lonza	12-722F
Magnesium chloride	VWR	BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads	Invitrogen	10103D
Mailer tubes	EMS	EMS71406-10
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns	Biorad	7326200	In SSC Buffer
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-biotin	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide	VWR	470302-132
Protein, Protein G	Abcam	ab155724	N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc	R&D System	137-PS	Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin	Cedarlane	CL1005-01-5MG
Pump Syringe	Harvard Apparatus	704801
Sodium bicarbonate	Ward’s Science	470302-444
Sodium chloride	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
Syringe	Hamilton	81520	Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles	BD	305115	Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor	Tygon	ABW00001	Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene	BD Intramedic	427406	Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773