Imaging Molekylær vedhæftning i Cell Rolling ved vedhæftning Fodaftryk Assay
Summary
Denne protokol præsenterer de eksperimentelle procedurer til at udføre vedhæftning fodaftryk assay til billede vedhæftning begivenheder under hurtig celle rullende vedhæftning.
Abstract
Rullende vedhæftning, lettet af selectin-medieret interaktioner, er en meget dynamisk, passiv motilitet i at rekruttere leukocytter til stedet for betændelse. Dette fænomen forekommer i postcapillary venules, hvor blodgennemstrømningen skubber leukocytter i en rullende bevægelse på endotelcellerne. Stabil rulning kræver en delikat balance mellem vedhæftningsbindingsdannelse og deres mekanisk drevne dissociation, så cellen kan forblive fastgjort til overfladen, mens den ruller i strømmens retning. I modsætning til andre vedhæftningsprocesser, der forekommer i relativt statiske miljøer, er rullende vedhæftning meget dynamisk, da de rullende celler bevæger sig over tusindvis af mikron med snesevis af mikron i sekundet. Derfor er konventionelle mekanobiologiske metoder såsom trækkraftmikroskopi uegnede til måling af de enkelte vedhæftning og de tilhørende molekylære kræfter på grund af den korte tidshorisont og høj følsomhed, der kræves. Her beskriver vi vores seneste implementering af vedhæftning fodaftryk assay til billede P-selectin: PSGL-1 interaktioner i rullende vedhæftning på molekylært niveau. Denne metode udnytter irreversible DNA-baserede spændingsmåler tøjre til at producere en permanent historie af molekylære vedhæftning begivenheder i form af fluorescens spor. Disse spor kan afbildes på to måder: (1) syning sammen tusindvis af diffraction-begrænsede billeder til at producere et stort synsfelt, der muliggør udvinding af vedhæftning fodaftryk af hver rullende celle over tusindvis af mikron i længden, (2) udfører DNA-PAINT at rekonstruere super-opløsning billeder af fluorescens spor inden for et lille synsfelt. I denne undersøgelse, vedhæftning fodaftryk assay blev brugt til at studere HL-60 celler rullende på forskellige forskydning understreger. Ved at gøre det var vi i stand til at forestille os den rumlige fordeling af P-selectin: PSGL-1 interaktion og få indsigt i deres molekylære kræfter gennem fluorescensintensitet. Denne metode danner således grundlag for den kvantitative undersøgelse af de forskellige celleoverfladeinteraktioner, der er involveret i rullende vedhæftning på molekylært niveau.
Introduction
Den rullende vedhæftning kaskade beskriver, hvordan cirkulerende celler binde til og rulle langs blodkarvæggen1. Passiv rullende er primært medieret af selectins, en stor klasse af cellulære vedhæftning molekyler (CAMs)1. Under forskydningen af blod danner leukocytter, der udtrykker P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), meget forbigående bindinger med P-selectin, som kan udtrykkes på overfladen af betændte endotelceller. Denne proces er afgørende for leukocytter at migrere til et sted for inflammation2. Derudover er PSGL-1 også en mechanosensitiv receptor, der er i stand til at udløse den efterfølgende faste vedhæftningsfase af den rullende vedhæftningskaskade ved dets engagement med P-selectin3.
Genetiske mutationer, der påvirker CAM-funktionen, kan alvorligt påvirke immunsystemet, såsom i den sjældne sygdom af leukocyt vedhæsionsmangel (LAD), hvor funktionsfejl i vedhæftningsmolekyler, der formidler rullende, fører til alvorligt immunkompromitterede individer4,5,6. Derudover har cirkulerende tumorceller vist sig at migrere efter en lignende rullende proces, hvilket fører til metastaser7,8. Men fordi cellerullende er hurtig og dynamisk, konventionelle eksperimentelle mekanobiologi metoder er uegnede til at studere molekylære interaktioner under celle rullende. Mens enkeltcellede og enkeltmolekyle manipulationsmetoder som atomprøvesprængningsmikroskopi og optisk pincet var i stand til at studere molekylære interaktioner som P-selectins kraftafhængige interaktion med PSGL-1 på enkeltmolekyleniveau9, er de uegnede til at undersøge levende vedhæftning hændelser under cellerullende. Derudover kan interaktionen karakteriseret in vitro ikke direkte besvare spørgsmålet om molekylær vedhæhæftning in vivo. Hvilket molekylært spændingsområde er f.eks. biologisk relevant, når celler fungerer i deres oprindelige miljø? Beregningsmetoder såsom selvklæbende dynamik simulering10 eller simpel steady-state model11 har fanget visse molekylære detaljer, og hvordan de påvirker den rullende adfærd, men er meget afhængige af nøjagtigheden af modellering parametre og antagelser. Andre teknikker såsom trækkraftmikroskopi kan detektere kræfter under cellemigration, men giver ikke tilstrækkelig rumlig opløsning eller kvantitative oplysninger om molekylær spænding. Ingen af disse teknikker kan give direkte eksperimentelle observationer af den tidsmæssige dynamik, rumlige fordeling og størrelse heterogenitet af molekylære kræfter, som direkte vedrører cellefunktion og adfærd i deres oprindelige miljø.
Derfor er implementering af en molekylær kraftsensor, der er i stand til nøjagtigt at måle udvalgteinmedierede interaktioner, afgørende for at forbedre vores forståelse af rullende vedhæftning. Her beskriver vi protokollen for vedhæftning fodaftryk assay12 hvor PSGL-1 belagt perler er rullet på en overflade præsentere p-selectin funktionaliseret spænding gauge tethers (TGTs)13. Disse TGT’er er irreversible DNA-baserede kraftsensorer, der resulterer i en permanent historie med brudhændelser i form af fluorescensudlæsning. Dette opnås gennem brud på TGT (dsDNA) og derefter efterfølgende mærkning af den bristede TGT (ssDNA) med en fluorescerende mærket komplementær streng. En stor fordel ved dette system er dets kompatibilitet med både diffraktionsbeskret og superopløsningsbilleddannelse. Den fluorescerende mærkede komplementære streng kan enten være permanent bundet (>12 bp) for diffraktionsbegrænset billeddannelse eller forbigående bundet (7-9 bp) til billeddannelse i superopløsning gennem DNA PAINT. Dette er et ideelt system til at studere rullende vedhæftning som TGTs er bristet under aktiv rullende, men fluorescens udlæsning er analyseret post-rullende. De to billeddannelsesmetoder giver også brugeren mere frihed til at undersøge rullende vedhæftning. Typisk, diffraktion-begrænset billeddannelse er nyttig til udvinding molekylær brudkraft gennem fluorescens intensitet13, mens super-opløsning billeddannelse giver mulighed for kvantitativ analyse af receptortæthed. Med evnen til at undersøge disse egenskaber ved rullende vedhæftning giver denne tilgang en lovende platform for forståelse af kraftreguleringsmekanismen på den molekylære vedhæftning af rullende celler under forskydningsstrømning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vedhæftning fodaftryk assay muliggør visualisering af molekylær vedhæftning begivenheder mellem PSGL-1 og P-selectin under celle rullende vedhæftning. Denne proces er initieret af P-selectin-medieret optagelse efterfulgt af rullende under fluidisk forskydning stress. Potentielle problemer i løbet af eksperimentet involverer normalt dårlig celle rullende eller manglende fluorescerende spor, selv når cellerne ruller godt. Disse problemer skyldes ofte kvalitetskontrol ved de kritiske trin i protokollen, som angivet …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) og University of British Columbia Eminence Fund.
Materials
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
References
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules – Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
