이 프로토콜은 5'splice 사이트 돌연변이가 접합에 미치는 영향을 모니터링하기 위한 미니유전자 기자 분석체를 설명하고 돌연변이 유발 접합 억제를 위한 억제기 U1 snRNA를 개발한다. 리포터 및 억제기 U1 snRNA 구조는 HeLa 세포에서 발현되고, 접합은 프라이머 확장 또는 RT-PCR에 의해 분석된다.
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이 논문에서
요약
초록
유전자 발현 동안, pre-mRNA 접합의 중요한 단계는 성숙한 mRNA의 세포질 수출 의 앞에 엑손에 합류하고 인트론을 제거하기 위하여 스플라이스 사이트의 정확한 인식 및 pliceosomal 복합체의 능률적인 조립을 관련시킵니다. 접합 효율은 스플라이스 부위의 돌연변이 존재, 트랜스 작용 접합 인자의 영향 또는 치료제의 활동에 의해 변경될 수 있다. 여기에서는 주어진 exon의 접합 효율을 모니터링하기 위해 적용할 수 있는 셀룰러 분석프로토콜을 설명합니다. 분석법은 적응형 플라스미드 인코딩된 3-엑손/2-intron 미니진 리포터를 사용하며, 이는 일시적인 과도 경질에 의해 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 전염 후, 총 세포 RNA는 단리되고, 기자 mRNA에서 결합하는 엑슨의 효율은 프라이머 확장 또는 반정량 역전사-폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 결정된다. 우리는 어떻게 관련된 질병의 충격을 설명합니다 5′ 스플라이스 사이트 돌연변이는 기자에 그(것)들을 소개하여 결정될 수 있습니다; 그리고 이러한 돌연변이의 억제는 U1 작은 핵 RNA (snRNA)와 의 결합에 의해 달성 될 수있는 방법 5′ 지역에서 보상 돌연변이를 운반 하는 구성 은 사전 mRNAs에 있는 엑손 인 트론 접합부에서 5′splice 사이트와 기질. 따라서, 리포터는 돌연변이 5′ 스플라이스 사이트의 인식을 향상시키기 위해 치료 U1 입자의 설계에 사용될 수 있다. 인핸서 또는 소음기 시퀀스를 접합하는 것과 같은 시스 작용 규제 사이트를 리포터에 삽입하여 특정 대체 접합 계자에 의해 중재된 규제에서 U1 snRNP의 역할을 검사하는 데도 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 세포를 발현하는 기자는 소분자로 배양하여 구성적인 사전 mRNA 접합 또는 돌연변이 5′ 스플라이스 부위를 운반하는 엑슨에 잠재적 인 치료법의 효과를 결정할 수 있습니다. 전반적으로, 리포터 분석은 기본적인 접합 기계장치 및 접합 관련 질병을 연구하기 위하여 다양한 조건에서 접합 효율을 감시하기 위하여 적용될 수 있습니다.
서론
pre-mRNA 접합은 비코딩 인트론을 제거하고 코딩 엑손을 정확하게 리게이트하여 성숙한 mRNA를 형성하는 필수적인 처리 단계입니다. 5′-스플라이스 사이트 및 3′-스플라이스 사이트라고 하는 엑손 인트론 교차로에서 컨센서스 시퀀스를 인식하는 것은 접합 기계의 구성 요소에 의해 접합 과정을 시작합니다. U1 소형 핵리보뉴클레오프로틴(snRNP)은 U1 snRNA를 사전 mRNA1에 기본 페어링하여 5′-스플라이스 부위를 인식합니다. 5′-스플라이스 사이트 서열을 변경하는 유전적으로 승계한 돌연변이는 많은 질병2,3와 연관됩니다. U1 snRNA의 염기 페어링을 돌연변이 5′-스플라이스 사이트로 손상하면 비정상적인 접합이 발생하여 영향을 받는 성적증명서의 번역을 손상시킬 수 있습니다. 접합 결함을 해결하기 위한 잠재적인 치료 접근법은 5′-splice 사이트와 기초가 되는 5′-지구에 있는 보상 뉴클레오티드 변경을 운반하는 수정된 U1 ....
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프로토콜
1. 시약 및 버퍼
참고: 진공 필터를 사용한 모든 멸균은 생물 안전 캐비닛에 0.2 μm polyethersulfone(PES) 멤브레인으로 수행해야 합니다.
- 1.0mL의 디틸피로카보네이트(DEPC)를 1.0L의 디에이온화된 물에 첨가하고, 실온(RT)에서 최소 1시간 이상 섞은 다음, 사용하기 전에 RT로 식힙니다.
- DMEM 분말 1패킷(13.4g), 중탄산나트륨 3.7g, 태아소 혈청(FBS), 페니실린 100mL, 멸균 데리온 화물 800mL를 혼합하여 덜벡코의 수정이이글 배지(DMEM)를 준비한다. DMEM의 페니실린 및 연쇄 절제술의 최종 농도는 각각 50 U/mL 및 50 μg/mL이어야 합니다. pH를 7.4로 조정한 다음 멸균 분수로 부피를 1.0L로 구성합니다. 여과에 의해 살균하고 4 °C에 보관하십시오.
- 25.6 g의 디나트륨 수소 이질산염(Na2HPO4·10x PBS)을 추가하여 10배 인산완충식식(10배 PBS)을 준비하세요. 7H2O), 이수소 인산염 2g(KH2PO4), 염화칼륨 2g(KCl), 염화나트륨 80g~800mL의 탈이온화수....
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결과
접합 기자 Dup51, 3 개의 엑손-2 인트론 미니진은 인간 β-글로빈 유전자로부터 유래되었으며 이전에 설명되었다(그림 1A)11,12. 우리는 돌연변이 기자, Dup51p, 프로토 카데린 의 엑슨 3에서 발생하는 Usher 증후군 과 관련된 5'splice 사이트 돌연변이를 도입하여 15 (PCDH15) gene13. 엑손 2-인트론 2 접합부에서의 5'splice 사이트 서열은 CAG/GUUGGUAUC에서 AUG/GUGUGUAUC로 변경되었습니다(//엑손인트론 경계)(그림 1B)14. 이러한 서열 변화는 내인성 U1 snRNA와 5'-스플라이스 부위 베이스페어링의 예측 패턴을 변경하고 성숙한 성적증명서에서 엑슨 2.......
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토론
분석은 HeLa 이외의 세포주에서 접합 분석을 위해 적응될 수 있지만, 세포 합류 및 DNA의 양과 같은 형질 응력에 영향을 미치는 요인은 최적화될 필요가 있다. 리포터에서 U1 구문비는 다른 세포 유형에서 관찰된 발현 수준에 따라 결정되어야 할 수 있는 또 다른 중요한 매개 변수이다. 추출된 RNA의 품질은 접합 분석에 중요합니다. 따라서 RNase 비활성화 제의 로 RNase 가없는 물 및 표면의 오염 제거를 사용하는 것이 좋습니다.
프라이머 확장 또는 형광 RT-PCR에 의한 리포터 성적증명서의 분석은 유사한 결과를 산출하므로 성숙한 성적증명서에 엑슨 2의 포함 변화를 모니터링하기 위해 어느 기술을 사용할 수 있다. 형광 PCR 반응은 초기 RNA 농도에 의존하는 증폭의 기하급수단계에서 중지되고 정량화되어야 합니다. 따라서, 증폭 주기의 수는 여기에 설명된 것과 다른 형질 계류 조건을 가진 저술에 대해 결정되어야 할 수도 있다. 비방사성 특성으로 인한 사용의 용이성은 RT-.......
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공개 사항
저자는 공개 할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 국립 보건원 (R21CA170786 및 R01GM127464)과 미국 암 학회 (기관 연구 보조금 74-001-34-IRG)와 밸리 연구 파트너십 프로그램 (P1-4009 및 VRP7)의 S.S. 및 W.M에 대한 자금으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 등급 탈이온수 | ThermoFisher Scientific | 23-751628 | |
| 디에틸 피로카보네이트(DEPC) | Sigma-Aldrich | D5758-25ML | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 분말 패킷 | Gibco | 12100-046 | |
| 중탄산나트륨 | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| 소 태아 혈청(FBS), 호주 출처, 열 비활성화 | Omega Scientific | FB-22 | |
| 페니실린-스트렙토마이신(P/S) | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| 수산화나트륨, 표준 용액 1.0N | Sigma-Aldrich | S2567-16A | |
| 염산, ACS Plus 인증, 36.5 - 38.0% | ThermoFisher Scientific | A144-500 | |
| 일회용 PES 병 뚜껑 필터 | ThermoFisher Scientific | FB12566510 | |
| EDTA 디소듐 염 디하이드레이트 | Amresco | 0105-2.5KG | |
| 2.5% 트립신(10x), 페놀 레드 없음 | ThermoFisher Scientific | 15090046 | |
| 염화나트륨 | Fisher Bioreagent | BP358-212 | |
| 염화칼 | Fisher Bioreagent | BP366-1 | |
| 디소듐 인산수소 헵타하이드레이트 | 피셔 바이오시약 | BP332-1 | |
| 포타슘 디하이드로겐 인산 | 피셔 바이오시약 | BP362-1 | |
| 트랜스펙션 배지 - Opti-MEM™ 나는 혈청 매체, 페놀 레드 없음 | ThermoFisher Scientific | 11058021 | |
| Transfection 시약 - Lipofectamine™ 2000 | ThermoFisher Scientific | 13778150 | |
| TRIzol™ 시약 | ThermoFisher Scientific | 15596018 | |
| 클로로포름(방부제/분자생물학으로서의 약 0.75% 에탄올) | ThermoFisher Scientific | BP1145-1 | |
| 에탄올, 절대(200프루프), 분자생물학 등급, Fisher BioReagents ThermoFisher | Scientific | BP2818-4 | |
| 이소프로판올, 분자생물학 등급, Fisher BioReagents | ThermoFisher Scientific | BP2618-212 | |
| 글리코겐 (5 mg/ml) | ThermoFisher Scientific | AM9510 | |
| Direct-zol RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R2052 | |
| ATP, [γ-32P]- 6000Ci/mmol 150mCi/ml 납, 1 mCi | PerkinElmer | NEG035C001MC | |
| T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 | New England Biolabs | M0201L | |
| 크기 제외 콩 - 세파덱스® G-25 | Sigma-Aldrich | G2580-10G | |
| 크기 제외 미니 컬럼 | USA Scientific | 1415-0600 | |
| pBR322 DNA-MspI Digest | New England Biolabs | N3032S | |
| 저분자량 마커, 10-100 nt | Affymetrix | 76410 100 UL | |
| Rnase 비활성화 시약 - RNaseZAP™ | Sigma-Aldrich | R2020-250ML | |
| dNTP 믹스 (10 mM ea) | ThermoFisher Scientific | 18427013 | |
| RNaseOUT™ 재조합 리보뉴클레아제 억제제 | ThermoFisher Scientific | 10777019 | |
| 역전사효소 - M-MLV 역전사효소 | 머 확장에 사용되는 | ThermoFisher Scientific | 28025013 |
| Taq DNA 중합효소 | ThermoFisher Scientific | 10342020 | |
| 랜덤 헥사머(50 µ M) | ThermoFisher Scientific | N8080127 | |
| 실시간 PCR 믹스 - SYBR™ Master: | ThermoFisher Scientific | 4472903 | |
| SuperScript™ III 역전사 효소 | ThermoFisher Scientific | 18080093 | cDNA 준비에 사용됨 |
| 디티오트레이톨 (DTT) | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 5X First-Strand Buffer | ThermoFisher Scientific | 18080093 | |
| 포름아미드 (≥ 99.5%) | ThermoFisher Scientific | BP228-100 | Review 물질안전보건자료 |
| 브로모페놀 블루 나트륨염 | 시그마-알드리치 | 114405-5G | |
| 자일렌 시아놀 FF | 시그마-알드리치 | 2650-17-1 | |
| 트리스 베이스(백색 결정 또는 결정성 분말/분자생물학) | ThermoFisher Scientific | BP152-5 | |
| 붕산(결정성/ 전기영동) | ThermoFisher Scientific | BP168-500 | |
| 아크릴아미드: 비스-아크릴아미드 19:1 (40% 용액/전기영동) | ThermoFisher Scientific | BP1406-1 | Review 물질안전보건자료 |
| 요소(무색-백색 결정 또는 결정성 분말/mol. biol.) | ThermoFisher Scientific | BP169-212 | |
| 과산화이황산암모늄(APS) ≥ 98%, Pro-Pure, 단백질체학 등급 | VWR | M133-25G | |
| 시그마코트 | 시그마-알드리치 | SL2-100ML | |
| N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED) ≥ 99%, 초순수 | VWR | 0761-25ML | 검토 재료 안전 데이터 시트 |
| 조절 가능한 슬랩 젤 시스템, Expedeon | VWR | ASG-400 | |
| 수직 젤 랩 & 트레이드; 유리 플레이트 세트, 16.5 x 14.5cm | VWR | NGP-125NR | |
| 수직 젤 랩&트레이드; 유리 플레이트 세트, 16.5 x 22.0cm | VWR | NGP-200NR | |
| 수직 젤 랩&트레이드; 유리 플레이트 세트, 16.5 x 38.7cm | VWR | NGP-400NR | |
| GE 저장 인광 스크린 | Sigma-Aldrich | GE28-9564 | |
| Typhoon™ FLA 7000 생체 분자 이미저 | GE Healthcare | , 28-9610-73, AB | |
| Beckman Coulter, LS6500 액체 섬광 계수기, | GMI | 8043-30-1194 | |
| C1000 터치 열 순환기 | , ThermoFisher Scientific | ||
| , QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR 시스템 | , ThermoFisher Scientific |
참고문헌
- Zhuang, Y., Weiner, A. M. A compensatory base change in U1 snRNA suppresses a 5' splice site mutation. Cell. 46 (6), 827-835 (1986).
- Scotti, M. M., Swanson, M. S. RNA mis-splicing in disease. Nature Review Genetics. 17 (1), 19-32 (2016).
- Ward, A. J., Cooper, T. A.
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재인쇄 및 허가
