Lipid monolayers er blevet brugt som et fundament for at danne to-dimensionelle (2D) protein krystaller til strukturelle undersøgelser i årtier. De er stabile ved luft-vand interface og kan tjene som en tynd støtte materiale til elektron imaging. Her præsenterer vi de dokumenterede trin til forberedelse af lipidmonomer til biologiske undersøgelser.
Elektronkrystallografi er et kraftfuldt værktøj til strukturbestemmelse med høj opløsning. Makromolekyler såsom opløselige eller membranproteiner kan dyrkes til højt ordnede todimensionelle (2D) krystaller under gunstige forhold. Kvaliteten af de dyrkede 2D-krystaller er afgørende for opløsningen af den endelige genopbygning via 2D-billedbehandling. I årenes løb er lipidmonomer blevet brugt som et støttelag til at fremme 2D-krystallisering af perifere membranproteiner samt opløselige proteiner. Denne metode kan også anvendes på 2D krystallisering af integrerede membranproteiner, men kræver mere omfattende empirisk undersøgelse for at bestemme vaskemiddel og dialyse betingelser for at fremme partitionering til monolayer. En lipid monolayer dannes på luft-vand interface således, at polar lipid hoved grupper forbliver hydreret i den vandige fase og de ikke-polære, acyl kæder, haler partition i luften, bryde overfladespændingen og udfladning vandoverfladen. Hovedgruppernes ladede natur eller karakteristiske kemiske moieties giver affinitet for proteiner i opløsning, der fremmer binding til 2D-arraydannelse. En nydannet monolag med 2D-arrayet kan let overføres til et elektronmikroskop (EM) på et kulstofbelagt kobbergitter, der bruges til at løfte og understøtte det krystallinske array. I dette arbejde beskriver vi en lipid monolayer metode til kryogen elektron mikroskopisk (cryo-EM) billeddannelse.
Elektron diffraktion gennem 2D krystaller eller spiralformede arrays af proteiner kan opnå sub-nanometer opløsninger i gunstige tilfælde1,2,3. Af særlig interesse er rekonstitueret 2D membran protein arrays eller krystaller i deres nær-indfødte miljøer1. Fordi en krystal fungerer som en signalforstærker øge intensiteten af de strukturelle faktorer ved specifikke rumlige frekvenser, elektron krystallografi tillader sondering et mål med en mindre størrelse ved høje opløsninger, såsom små molekyler, end dem for enkelt-partikel cryo-EM. Elektronstrålen kan diffrakteres af en ordnet 2D-vifte af proteiner, hvilket genererer et diffraktionsmønster eller et gitterbillede afhængigt af, hvor billedplanet er optaget pådetektoren 4. De diffracted intensiteter kan derefter udvindes og behandles for at rekonstruere en 2D projektion struktur af krystallen. Elektroner har en større spredning tværsnit end røntgenstråler og dens spredning for det meste følger Rutherford model baseret på Coulomb interaktion mellem elektroner og ladede atomer imolekylet 5. Tykkelserne af 2D-membrankrystaller er normalt mindre end 100 nm, egnet til elektrontransmission uden dynamisk spredning, der forekommer i prøve6. Elektronkrystalgrafiske undersøgelser har vist sig at være et kraftfuldt værktøj til at sondere strukturelle oplysninger i høj opløsning af membranproteiner og lipidproteininteraktioner7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.
En lipid monolayer er et enkelt lipidlag bestående af fosfolipider tæt pakket ved en luft-vand interface6, som kan hjælpe 2D array dannelse for opløselige proteiner eller perifere membran proteiner18. Afhængigt af lipidernes massefylde og deres laterale tryk kan lipidmolekylerne danne et ordnet 2D-array på luftvandsgrænsefladen med deres acylkæder udvidet til luften og hydrofile hovedgrupper, der eksponeres i den vandige opløsning1,6,19. Lipid hovedgruppen kan interagere med proteiner via elektrostatisk interaktion eller kan ændres til at give en affinitet tag til at binde et bestemt protein domæne. For eksempel bruges DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni2+) ofte til at danne en lipid monolayer til at binde proteinerne med et poly-histidin tag20,21,22. Også kolera toksin B kan binde en bestemt pentasaccharid af ganglioside GM1 i en lipid monolayer til strukturelle undersøgelser23,24. Ved at forankre proteinerne på lipidhovedgrupperne kan lipidmonomonlayeren hjælpe med dannelsen af 2D-arrays, der er tynde til elektronkrystalgrafiske undersøgelser med høj opløsning. Lipid monolayer teknikken er blevet anvendt i elektronkrystallografi til strukturelle undersøgelser af proteiner, såsom streptavidin2,25, annexin V26, kolera toksin27, E. coli gyrase B subunit28, E. coli RNA polymerase25,29,30, carboxysome shell proteiner31 og capsid proteiner hiv-132 og Moloney murin leukæmi virus 33. På grund af stabiliteten og den kemiske egenskab af lipid monolayer, forskellige anvendelser for prøve forberedelse er blevet undersøgt for cryo-EM imaging34. Optimering vil dog være nødvendig for protein array dannelse.
Her giver vi omfattende detaljer om den generelle forberedelse af lipidmonomer til kryo-EM-billeddannelse og nogle overvejelser, der kan påvirke kvaliteten af de dannede monolayers.
En lipid monolayer er et kraftfuldt værktøj, der letter væksten af store 2D-krystaller til strukturelle undersøgelser af biologiske makromolekyler. For at kunne forberede en intakt lipid monolayer på luft-vand interface, anbefales det kraftigt, at lipider fremstilles frisk på dagen for eksperimentet, fordi oxidering af lipid acyl kæde kan føre til pakning forstyrrelser i monolayer og negativt påvirke den resulterende krystal dannelse. Købte lipider i pulverform skal opløses ved hjælp af en blanding af chlorof…
The authors have nothing to disclose.
Udarbejdelsen af dette manuskript blev delvist støttet af US Army Research Office (W911NF2010321) og Arizona State University start midler til P.-L.C.
14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
Ultra-pure water | |||
Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |