Preparazione del campione utilizzando un metodo monostrato lipidico per studi cristallografici elettronici

Summary

I monostrati lipidici sono stati utilizzati come base per la formazione di cristalli proteici bidimensionali (2D) per studi strutturali per decenni. Sono stabili all’interfaccia aria-acqua e possono fungere da materiale di supporto sottile per l’imaging elettronico. Qui presentiamo i passaggi comprovati sulla preparazione di monostrati lipidici per studi biologici.

Abstract

La cristallografia elettronica è un potente strumento per la determinazione della struttura ad alta risoluzione. Le macromolecole come le proteine solubili o di membrana possono essere coltivate in cristalli bidimensionali (2D) altamente ordinati in condizioni favorevoli. La qualità dei cristalli 2D cresciuti è fondamentale per la risoluzione della ricostruzione finale tramite l’elaborazione di immagini 2D. Nel corso degli anni, i monostrati lipidici sono stati utilizzati come strato di supporto per favorire la cristallizzazione 2D delle proteine di membrana periferica e delle proteine solubili. Questo metodo può essere applicato anche alla cristallizzazione 2D di proteine di membrana integrali, ma richiede un’indagine empirica più ampia per determinare le condizioni di detergente e dialisi per promuovere la suddivisione nel monostrato. Un monostrato lipidico si forma all’interfaccia aria-acqua in modo tale che i gruppi di testa lipidica polare rimangano idratati nella fase acquosa e le catene acilice non polari, le code si dividano nell’aria, rompendo la tensione superficiale e appiattindo la superficie dell’acqua. La natura carica o le parti chimiche distintive dei gruppi di testa forniscono affinità per le proteine in soluzione, promuovendo il legame per la formazione di array 2D. Un monostrato di nuova formazione con l’array 2D può essere facilmente trasferito in un microscopio elettronico (EM) su una griglia di rame rivestita di carbonio utilizzata per sollevare e supportare l’array cristallino. In questo lavoro, descriviamo una metodologia monostrato lipidico per l’imaging criogenico al microscopio elettronico (crio-EM).

Introduction

La diffrazione elettronica attraverso cristalli 2D o matrici elicoidali di proteine può raggiungere risoluzioni sub-nanometriche in casi favorevoli^1,2,3. Di particolare interesse sono gli array di proteine di membrana 2D ricostituite o i cristalli nei loro ambienti quasi nativi¹. Poiché un cristallo agisce come un amplificatore di segnale migliorando l’intensità dei fattori strutturali a specifiche frequenze spaziali, la cristallografia elettronica consente di sondare un bersaglio con dimensioni più piccole ad alte risoluzioni, come piccole molecole, rispetto a quelle per la crio-EM a singola particella. Il fascio di elettroni può essere diffratto da una matrice 2D ordinata di proteine, generando un modello di diffrazione o un’immagine reticolare a seconda di dove viene registrato il piano dell’immagine sul rivelatore⁴. Le intensità diffratte possono quindi essere estratte ed elaborate per ricostruire una struttura di proiezione 2D del cristallo. Gli elettroni hanno una sezione trasversale di scattering più grande dei raggi X e la sua diffusione segue principalmente il modello di Rutherford basato sull’interazione di Coulomb tra gli elettroni e gli atomi carichi nella molecola⁵. Gli spessori dei cristalli a membrana 2D sono solitamente inferiori a 100 nm, adatti per la trasmissione di elettroni senza dispersione dinamica che si verifica all’interno del campione⁶. Gli studi cristallografici elettronici hanno dimostrato di essere un potente strumento per sondare informazioni strutturali ad alta risoluzione delle proteine di membrana e delle interazioni lipidico-proteina^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.}

Un monostrato lipidico è un singolo strato lipidico composto da fosfolipidi densamente impacchettati in un’interfaccia aria-acqua⁶, che può aiutare la formazione di array 2D per proteine solubili o proteine di membrana periferica¹⁸. A seconda della densità dei lipidi e della loro pressione laterale, le molecole lipidiche possono formare un array 2D ordinato sull’interfaccia aria-acqua con le loro catene acilice estese all’aria e gruppi di testa idrofili esposti nella soluzione acquosa^1,6,19. Il gruppo lipidico può interagire con le proteine tramite interazione elettrostatica o può essere modificato per fornire un tag di affinità per legare un dominio proteico specifico. Ad esempio, il DOGS-NTA-Ni (acido 1,2-dioleoil- sn-glicero-3-[(N-(5-ammino-1-carbossipentil)acido iminodiacetico)succinil]^2- Ni²⁺) viene spesso utilizzato nella formazione di un monostrato lipidico per legare le proteine con un tag poli-istidina^20,21,22. Inoltre, la tossina B del colera può legare un particolare pentasaccaride del ganglioside GM1 in un monostrato lipidico per studi strutturali^23,24. Ancorando le proteine sui gruppi di testa lipidica, il monostrato lipidico può aiutare la formazione degli array 2D che sono sottili per studi cristallografici elettronici ad alta risoluzione. La tecnica lipidica monostrato è stata utilizzata in cristallografia elettronica per studi strutturali di proteine, quali streptavitina^2,25,annessina V^26,tossina colera^27, E. coli girasi B subunità^28, E. coli RNA polimerasi^25,29,30,carbossisoma shell proteins³¹ e le proteine capside del virus HIV-1³² e Moloney murine leucemia virus ³³. A causa della stabilità e delle proprietà chimiche del monostrato lipidico, sono state esplorate diverse applicazioni per la preparazione del campione per l’imaging crio-EM³⁴. Tuttavia, sarà necessaria l’ottimizzazione per la formazione di array proteici.

Qui, forniamo ampi dettagli sulla preparazione generale dei monostrati lipidici per l’imaging crio-EM e alcune considerazioni che potrebbero influenzare la qualità dei monostrati formati.

Protocol

1. Preparazione del blocco di teflon Preparare il blocco di Teflon da resina PTFE (politetrafluoroetilene) resistente agli agenti chimici. Praticate dei fori sul blocco utilizzando un trapano generale seguito dalle quote etichettate nella Figura 1. 2. Preparazione lipidica monostrato NOTA: Tempo di funzionamento stimato: 30-45 minuti Preparazione del brodo lipidico Prep…

Representative Results

Un monostrato lipidico depositato sulla griglia EM può essere visualizzato al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) senza macchie. La presenza del monostrato può essere riconosciuta dalla differenza di contrasto dall’area senza alcun campione nel percorso del fascio. Le aree che hanno una copertura lipidica monostrato hanno un contrasto locale inferiore rispetto a quelle senza copertura, poiché il fascio di elettroni attraverso i fori vuoti non ha dispersione e mostra un’illuminazione più luminosa (<strong cla…

Discussion

Un monostrato lipidico è un potente strumento che facilita la crescita di grandi cristalli 2D per studi strutturali di macromolecole biologiche. Per preparare con successo un monostrato lipidico intatto all’interfaccia aria-acqua, si raccomanda vivamente che i lipidi siano preparati appena il giorno dell’esperimento, perché l’ossidazione della catena lipidica acilico potrebbe portare a un’interruzione dell’imballaggio nel monostrato e influire negativamente sulla formazione di cristalli risultante. I lipidi acquistati …

Materials

14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996