전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

Summary

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

Abstract

전자 결정학은 고해상도 구조 측정을 위한 강력한 도구입니다. 수용성 또는 막 단백질과 같은 거대 분자는 유리한 조건하에서 고도로 정렬된 2차원(2D) 결정으로 재배될 수 있다. 2D 이미지 처리를 통해 최종 재구성의 해상도에 성장된 2D 결정의 품질은 매우 중요합니다. 수년에 걸쳐, 지질 단층은 용해성 단백질뿐만 아니라 말초 막 단백질의 2D 결정화를 촉진하기 위해 지원 층으로 사용되었습니다. 이 방법은 또한 일체형 막 단백질의 2D 결정화에 적용될 수 있지만 단층으로 분할을 촉진하기 위해 세제 및 투석 조건을 결정하기 위해 보다 광범위한 경험적 조사가 필요합니다. 지질 단층은 극지 지질 헤드 그룹이 수성 상에서 수분을 유지하고 비 극성, 아실 체인, 꼬리 분할을 공기로 분할하여 표면 장력을 깨고 수면을 평평하게 하는 공기-물 인터페이스에서 형성됩니다. 헤드 그룹의 충전 된 자연 또는 독특한 화학 적 moieties는 용액의 단백질에 대한 친화력을 제공하여 2D 어레이 형성에 대한 결합을 촉진합니다. 2D 어레이를 가진 새로 형성된 단층은 결정 배열을 들어 올리고 지원하는 데 사용되는 탄소 코팅 구리 그리드에서 전자 현미경(EM)으로 쉽게 이송될 수 있다. 이 작품에서, 우리는 극저온 전자 현미경 (극저온-EM) 화상 진찰을 위한 지질 단층 방법론을 기술합니다.

Introduction

2D 결정 또는 단백질의 헬릭 어레이를 통한 전자 회절은 유리한 경우^1,2,3에서하위 나노미터 분해능을 달성할 수 있다. 특히 관심은 근원 환경^1에서2D 멤브레인 단백질 어레이 또는 결정으로 재구성된다. 결정은 특정 공간 주파수에서 구조 적 인자의 강도를 향상시키는 신호 증폭기역할을하기 때문에, 전자 결정학은 단일 입자 저온-EM에 대한 것보다 작은 분자와 같은 고해상도에서 더 작은 크기로 대상을 프로빙 할 수 있습니다. 전자 빔은 주문된 2D 단백질 배열에 의해 확산될 수 있으며, 검출기^4에이미지 평면이 기록되는 위치에 따라 회절 패턴 또는 격자 이미지를 생성한다. 그 때 디질화 된 강도는 추출 및 크리스탈의 2D 프로젝션 구조를 재구성하기 위해 처리 될 수있다. 전자는 엑스레이보다 더 큰 산란 단면을 가지며, 그 산란은 주로 분자^5에서전자와 충전된 원자 사이의 쿨롬 상호 작용을 기반으로 하는 러더포드 모델을 따릅니다. 2D 멤브레인 결정의 두께는 일반적으로 100 nm 미만이며, 표본⁶내에서 발생하는 동적 산란없이 전자 전송에 적합합니다. 전자 결정학적 연구는 멤브레인 단백질및 지질 단백질 상호작용^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17의}고해상도 구조 정보를 조사하는 강력한 도구로 나타났다.

지질 단층은 공기-물 인터페이스^6에서조밀하게 포장된 인지질으로 구성된 단일 지질 층으로, 용해성 단백질 또는 말초막^{단백질(18)에}대한 2D 어레이 형성을 지원할 수 있다. 지질의 밀도와 측면 압력에 따라 지질 분자는 수성 용액^1,6,19에노출된 공기 및 친수성 헤드그룹에 확장된 아실 사슬을 사용하여 공기-물 인터페이스에 정렬된 2D 어레이를 형성할 수 있다. 지질 헤드그룹은 정전기 상호작용을 통해 단백질과 상호작용할 수 있거나 특정 단백질 도메인을 결합하기 위한 친화성 태그를 제공하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1-카박스티펜틸)이 iminodiacetic acid]]^{2-Ni 2+)는}폴리-히티딘 태그^20,21로단백질을 묶는 지질 단층층을 형성하는 데 자주 사용된다. 또한, 콜레라 독소 B는 구조적 연구를 위한 지질 단층에서 간질산 GM1의 특정 펜타카라이드를 결합할 수^{있다(23,24)}. 지질 헤드그룹에 단백질을 고정함으로써 지질 단층은 고해상도 전자 결정연구를 위해 얇은 2D 어레이의 형성을 지원할 수 있습니다. 지질 단층 기술은 단백질의 구조 연구를 위한 전자 결정학에서 사용되었습니다, 예를 들어 스트렙타비딘^2,25,부속서 V^26,콜레라 독소^27, 대장균 RNA 폴리머라제^25,29,30,카박스형 쉘 단백질³¹ 및 HIV-1³² 및 몰론 황두균 바이러스의 ^{캡시드 단백질 33.}지질 단층의 안정성 과 화학적 특성으로 인해, 시료 준비를 위한 다른 응용 분야는 극저온-EM^{이미징(34)에}대해 탐구되었다. 그러나, 단백질 어레이 형성을 위해 최적화가 필요합니다.

여기에서, 우리는 극저온-EM 화상 진찰을 위한 지질 단층의 일반적인 준비의 광대한 세부 사항 및 형성된 단층의 질에 영향을 미칠 수 있는 몇몇 고려사항을 제공합니다.

Protocol

1. 테플론 블록 준비 화학성 PTFE(폴리테트라플루오로로틸렌) 수지로부터 테플론 블록을 준비합니다. 일반 드릴을 사용하여 블록에 구멍을 만들고 그림 1에표시된 치수를 만듭니다. 2. 모노레이어 지질 제제 참고: 예상 작동 시간: 30-45분 지질 재고 준비 9:1 (v/v) 클로로폼/메탄올에 0.01 …

Representative Results

EM 그리드에 증착된 지질 단층은 염색없이 전송 전자 현미경(TEM)으로 시각화될 수 있다. 단층의 존재는 빔 경로에 시편이 없는 영역과 의대조 차이로 인식될 수 있다. 지질 단층 커버리지가 있는 영역은 비어 있는 구멍을 통해 전자 빔이 산란되지 않고 더 밝은조명(도 3)을나타내기 때문에 커버리지가 없는 영역보다 국부적 대비가 낮습니다. 2D 단층 결정?…

Discussion

지질 단층은 생물학적 거대 분자의 구조 연구를 위한 대형 2D 결정의 성장을 용이하게 하는 강력한 도구입니다. 공기-물 인터페이스에서 온전한 지질 단층층을 성공적으로 준비하기 위해 지질 아실 체인의 산화가 단층의 포장 중단으로 이어질 수 있고 그로 인한 결정 형성에 악영향을 미칠 수 있기 때문에 실험 당일에 지질을 신선하게 준비하는 것이 좋습니다. 분말 형태로 구입한 지질은 일반적?…

Materials

14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996