Preparación de muestras utilizando un método de monocapa lipídica para estudios cristalográficos de electrones

Summary

Las monocapas lipídicas se han utilizado como base para formar cristales de proteína bidimensionales (2D) para estudios estructurales durante décadas. Son estables en la interfaz aire-agua y pueden servir como un material de soporte delgado para la obtención de imágenes electrónicas. Aquí presentamos los pasos comprobados en la preparación de monocapas lipídicas para estudios biológicos.

Abstract

La cristalografía electrónica es una herramienta poderosa para la determinación de estructuras de alta resolución. Las macromoléculas como las proteínas solubles o de membrana se pueden cultivar en cristales bidimensionales (2D) altamente ordenados en condiciones favorables. La calidad de los cristales 2D cultivados es crucial para la resolución de la reconstrucción final a través del procesamiento de imágenes 2D. A lo largo de los años, las monocapas lipídicas se han utilizado como capa de soporte para fomentar la cristalización 2D de proteínas de membrana periférica, así como proteínas solubles. Este método también se puede aplicar a la cristalización 2D de proteínas de membrana integral, pero requiere una investigación empírica más extensa para determinar las condiciones de detergente y diálisis para promover la partición a la monocapa. Se forma una monocapa lipídica en la interfaz aire-agua de tal manera que los grupos de cabeza lipídica polar permanecen hidratados en la fase acuosa y las cadenas de acilo no polares, las colas se dividen en el aire, rompiendo la tensión superficial y aplanando la superficie del agua. La naturaleza cargada o las partículas químicas distintivas de los grupos de cabeza proporcionan afinidad por las proteínas en solución, promoviendo la unión para la formación de matrices 2D. Una monocapa recién formada con la matriz 2D se puede transferir fácilmente a un microscopio electrónico (EM) en una rejilla de cobre recubierta de carbono utilizada para levantar y soportar la matriz cristalina. En este trabajo, describimos una metodología monocapa lipídica para imágenes criogénicas microscópicas electrónicas (crio-EM).

Introduction

La difracción de electrones a través de cristales 2D o matrices helicoidales de proteínas puede lograr resoluciones subnanométricas en casos favorables^1,2,3. De particular interés son las matrices reconstituidas de proteínas de membrana 2D o cristales en sus entornos casi nativos¹. Debido a que un cristal actúa como un amplificador de señal que mejora las intensidades de los factores estructurales a frecuencias espaciales específicas, la cristalografía electrónica permite sondear un objetivo con un tamaño más pequeño a altas resoluciones, como moléculas pequeñas, que las de la crio-EM de una sola partícula. El haz de electrones puede ser difractado por una matriz ordenada 2D de proteínas, generando un patrón de difracción o una imagen de red dependiendo de dónde se registre el plano de la imagen en el detector⁴. Las intensidades difractadas se pueden extraer y procesar para reconstruir una estructura de proyección 2D del cristal. Los electrones tienen una sección transversal de dispersión más grande que los rayos X y su dispersión sigue principalmente el modelo de Rutherford basado en la interacción de Coulomb entre los electrones y los átomos cargados en la molécula⁵. Los espesores de los cristales de membrana 2D suelen ser inferiores a 100 nm, adecuados para la transmisión de electrones sin dispersión dinámica que ocurre dentro de la muestra^6. Se ha demostrado que los estudios cristalográficos electrónicos son una herramienta poderosa para sondear información estructural de alta resolución de proteínas de membrana e interacciones lípido-proteína^{7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17.}

Una monocapa lipídica es una sola capa lipídica compuesta de fosfolípidos densamente empaquetados en una interfaz aire-agua⁶, que puede ayudar a la formación de la matriz 2D para proteínas solubles o proteínas de membrana periférica¹⁸. Dependiendo de la densidad de los lípidos y su presión lateral, las moléculas lipídicas pueden formar una matriz 2D ordenada en la interfaz aire-agua con sus cadenas de acilo extendidas al aire y grupos de cabeza hidrofílicos expuestos en la solución acuosa^1,6,19. El grupo de cabeza lipídica puede interactuar con las proteínas a través de la interacción electrostática o puede modificarse para proporcionar una etiqueta de afinidad para unirse a un dominio proteico específico. Por ejemplo, el DOGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]^2- Ni²⁺) se utiliza a menudo en la formación de una monocapa lipídica para unir las proteínas con una etiqueta de poli-histidina^20,21,22. Además, la toxina B del cólera puede unirse a un pentasacárido particular del gangliósido GM1 en una monocapa lipídica para estudios estructurales^23,24. Al anclar las proteínas en los grupos de cabeza de lípidos, la monocapa lipídica puede ayudar a la formación de las matrices 2D que son delgadas para estudios cristalográficos de electrones de alta resolución. La técnica de monocapa lipídica se ha utilizado en cristalografía electrónica para estudios estructurales de proteínas, como la estreptavidina^2,25,la anexina V^26,la toxina del cólera^27,la subunidad²⁸de la E. coli girasa B, la ARN polimerasa^25,29,30,las proteínas de la cubierta del carboxisoma³¹ y las proteínas de la cápside del VIH-1³² y el virus ^{de la leucemia murina de Moloney 33}. Debido a la estabilidad y propiedad química de la monocapa lipídica, se han explorado diferentes aplicaciones para la preparación de muestras para la obtención de imágenes crio-EM³⁴. Sin embargo, la optimización será necesaria para la formación de matrices de proteínas.

Aquí, proporcionamos detalles extensos de la preparación general de monocapas lipídicas para imágenes crio-EM y algunas consideraciones que podrían afectar la calidad de las monocapas formadas.

Protocol

1. Preparación del bloque de teflón Prepare el bloque de teflón a partir de resina de PTFE (politetrafluoroetileno) resistente a los productos químicos. Haga taladros en el bloque utilizando un taladro general seguido de las dimensiones etiquetadas en la Figura 1. 2. Preparación lipídica monocapa NOTA: Tiempo estimado de funcionamiento: 30- 45 minutos Preparación de stoc…

Representative Results

Una monocapa lipídica depositada en la rejilla EM se puede visualizar bajo un microscopio electrónico de transmisión (TEM) sin tinción. La presencia monocapa se puede reconocer por la diferencia de contraste del área sin ningún espécimen en la trayectoria del haz. Las áreas que tienen cobertura de monocapa lipídica tienen un contraste local más bajo que las que no tienen cobertura, ya que el haz de electrones a través de los agujeros vacíos no tiene dispersión y muestra una iluminación más brillante<strong…

Discussion

Una monocapa lipídica es una poderosa herramienta que facilita el crecimiento de grandes cristales 2D para estudios estructurales de macromoléculas biológicas. Para preparar con éxito una monocapa lipídica intacta en la interfaz aire-agua, se recomienda encarecidamente que los lípidos se preparen recién el día del experimento, ya que la oxidación de la cadena de acil lipídico podría provocar la interrupción del empaquetamiento en la monocapa y afectar negativamente la formación de cristales resultante. Los l…

Materials

14:0 PC (DMPC)	Avanti Lipids	850345	1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL
Bulb for small pipets	Fisher Scientific	03-448-21
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432
Desiccator vacuum	Southern Labware	55207
EM grids	Electron Microscopy Sciences	CF413-50	CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space
Filter paper	GE Healthcare Life Sciences	1001-090	Diameter 90 mm
Glass Pasteur pipets	Fisher Scientific	13-678-20A
Hamilton syringe (25 µL)	Hamilton Company	80465
Hamilton syringe (250 µL)	Hamilton Company	81165
Hamilton syringe (5 µL)	Hamilton Company	87930
Hamilton syringe (500 µL)	Hamilton Company	203080
Methanol	Sigma-Aldrich	M1775-1GA
Petri dish	VWR	25384-342	100 mm × 15 mm
Teflon block	Grainger	55UK05	60 µL wells with side injection ports, manually made
Tweezers	Electron Microscopy Sciences	78325	Various styles
Ultra-pure water
Ultrasonic cleaner	VWR	97043-996