Este protocolo demonstra como utilizar o hospedeiro vegetal para detectar proteínas salivares de cigarrinhas e proteínas virais de plantas liberadas por vetores cigarrinhas.
Insetos vetores transmitem horizontalmente muitos vírus de plantas de importância agrícola. Mais da metade dos vírus de plantas são transmitidos por insetos hemípteros que têm partes bucais sugadoras de perfuração. Durante a transmissão viral, a saliva do inseto faz a ponte vírus-vetor-hospedeiro porque os vírus vetores da saliva e as proteínas do inseto desencadeiam ou suprimem a resposta imune das plantas dos insetos para os hospedeiros das plantas. A identificação e análise funcional de proteínas salivares estão se tornando uma nova área de foco no campo de pesquisa das interações arbovírus-hospedeiro. Este protocolo fornece um sistema para detectar proteínas na saliva de cigarrinhas usando o hospedeiro da planta. O vetor cigarrinha Nephotettix cincticeps infectado com o vírus anão do arroz (RDV) serve como exemplo. A vitelogenina e a proteína P8 do capsídeo externo principal do RDV vetorado pela saliva de N. cincticeps podem ser detectadas simultaneamente na planta de arroz da qual N. cincticeps se alimenta . Este método é aplicável para testar as proteínas salivares que são temporariamente retidas no hospedeiro da planta após a alimentação do inseto. Acredita-se que este sistema de detecção beneficiará o estudo das interações hemiptera-vírus-planta ou hemiptero-planta.
O modo de transmissão vetor-hospedeiro das arboviroses, um problema fundamental, está na fronteira das ciências biológicas. Muitos vírus de plantas de importância agrícola são transmitidos horizontalmente por insetos vetores1. Mais da metade dos vírus de plantas são vetores por insetos hemípteros, incluindo pulgões, moscas-brancas, cigarrinhas, cigarrinhas e tripes. Esses insetos possuem características distintas que lhes permitem transmitir eficientemente vírus de plantas1. Possuem partes bucais sugadoras de piercing e se alimentam da seiva do floema e do xilema, e secretam sua saliva 1,2,3,4. Com o desenvolvimento e aprimoramento de técnicas, a identificação e análise funcional de componentes salivares vem se tornando um novo foco de intensas pesquisas. As proteínas salivares conhecidas na saliva incluem inúmeras enzimas, como pectinesterase, celulase, peroxidase, fosfatase alcalina, polifenoloxidase, sacarose,entre outras5,6,7,8,9,10,11,12,13 . As proteínas presentes na saliva também incluem eliciadores que desencadeiam a resposta de defesa do hospedeiro, alterando o desempenho dos insetos, e efetores que suprimem a defesa do hospedeiro, o que aumenta a aptidão dos insetos e componentes indutores de respostas patológicas do hospedeiro14,15,16,17. Portanto, as proteínas da saliva são materiais vitais para a comunicação entre insetos e hospedeiros. Durante a transmissão de vírus, a saliva secretada pelas glândulas salivares de insetos virulíferos sugadores de piercing também contém proteínas virais. Os componentes virais utilizam o fluxo de saliva para liberá-los do inseto para o hospedeiro da planta. Portanto, a saliva do inseto faz a ponte entre a interação tritrófica vírus-vetor-hospedeiro. Investigar a função biológica das proteínas da saliva secretadas por insetos virulíferos ajuda a entender a relação vírus-vetor-hospedeiro.
Para vírus animais, é relatado que a saliva de mosquitos medeia a transmissão e patogenicidade dos vírus do Nilo Ocidental (WNV) e Dengue vírus (DENV). A proteína da saliva AaSG34 promove a replicação e transmissão do vírus da dengue-2, enquanto a proteína da saliva AaVA-1 promove a transmissão do vírus DENV e Zika (ZIKV) por ativar a autofagia18,19. A proteína D7 da saliva de mosquitos pode inibir a infecção por DENV in vitro e in vivo via interação direta com os virions DENV e proteína recombinante do envelopeDENV 20. Em vírus de plantas, o begomovírus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induz a proteína salivar Bsp9 da mosca-branca, que suprime a imunidade mediada por WRKY33 do hospedeiro vegetal, para aumentar a preferência e o desempenho da mosca-branca, eventualmente aumentando a transmissão de vírus21. Como os estudos sobre o papel que as proteínas salivares de insetos desempenham em hospedeiros vegetais ficaram atrás daqueles de hospedeiros animais, um sistema estável e confiável para detectar as proteínas salivares em hospedeiros vegetais é urgentemente necessário.
O vírus da planta conhecido como vírus anão do arroz (RDV) é transmitido pela cigarrinha Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) com alta eficiência e de forma persistentemente propagativa22,23. O RDV foi relatado pela primeira vez como transmitido por um inseto vetor e causa uma doença grave do arroz na Ásia24,25. O virion é icosaédrico e esférico de camada dupla, e a camada externa contém a proteína P8 do capsídeoexterno 22. O período de transmissão circulativa do RDV em N. cincticeps é de 14 dias 26,27,28,29,30. Quando o RDV chega às glândulas salivares, os virions são liberados em cavidades armazenadas nas glândulas salivares por meio de um mecanismo semelhante à exocitose23. A vitelogenina (Vg) é o precursor da proteína da gema essencial para o desenvolvimento oocitário em fêmeas de insetos31,32,33. A maioria das espécies de insetos tem pelo menos um transcrito Vg de 6-7 kb, que codifica uma proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Os precursores proteicos da Vg geralmente podem ser clivados em fragmentos grandes (140 a 190 kDa) e pequenos (<50 kDa) antes de entrarem no ovário18,19. Análises proteômicas prévias revelaram a presença dos peptídeos derivados da Vg na saliva secretada da cigarrinha Recilia dorsalis, embora sua função seja desconhecida (dados não publicados). Recentemente é relatado que o Vg, que é secretado por via oral a partir de cigarrinhas, funciona como um efetor para danificar as defesas das plantas34. Não se sabe se o Vg de N. cincticeps também poderia ser liberado para o hospedeiro da planta com fluxo salivar, e então poderia desempenhar um papel na planta para interferir com as defesas da planta. Para determinar se N. cincticeps explora proteínas salivares, como Vg, para inibir ou ativar as defesas da planta, o primeiro passo é identificar as proteínas liberadas para a planta durante a alimentação. O entendimento do método de identificação das proteínas salivares presentes na planta é potencialmente essencial para explicar a função das proteínas da saliva e as interações entre Hemiptera e plantas.
No protocolo aqui apresentado, N. cincticeps é usado como exemplo para fornecer um método para examinar a presença de proteínas salivares no hospedeiro vegetal introduzidas através da alimentação de insetos. O protocolo detalha principalmente a coleta e detecção de proteínas salivares e é útil para investigações adicionais na maioria dos hemípteros.
A saliva secretada diretamente pelas glândulas salivares dos insetos perfurocortantes desempenha um papel fundamental, pois predigere e desintoxica os tecidos do hospedeiro e os fatores biológicos cruzados dos vetores nos hospedeiros 1,3,4. Os fatores biológicos entre reinos, incluindo eliciadores, efetores e pequenos RNAs, são críticos para a comunicação inseto-hospedeiro14,15,16<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (31772124 e 31972239) e da Fujian Agriculture and Forestry University (Grant KSYLX014).
Reagents | |||
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
Buffers and Solutions | |||
Buffer | Composition | Comments/Description | |
5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
Instruments | |||
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |