איתור חלבוני וירוס ורוק של וקטור עלה בצמח המארח
Summary
פרוטוקול זה מדגים כיצד להשתמש בצמח המארח כדי לזהות חלבוני רוק של חלבונים נגיפיים צמחיים וחלבונים נגיפיים צמחיים המשתחררים על ידי וקטורי עלים.
Abstract
וקטורי חרקים מעבירים אופקית וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים מועברים על ידי חרקים המיפטרניים שיש להם חלקי פה מוצצים חודרים. במהלך העברה ויראלית, רוק החרק מגשר בין הנגיף-וקטור-מארח מכיוון שווקטורי הרוק נגיפים, וחלבוני החרקים, מעוררים או מדכאים את התגובה החיסונית של צמחים מחרקים לפונדקאים צמחיים. הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של חלבוני רוק הופכים לתחום חדש של התמקדות בתחום המחקר של אינטראקציות ארבו-וירוס-מארח. פרוטוקול זה מספק מערכת לזיהוי חלבונים ברוק של עלעלים באמצעות הצמח המארח. וקטור ההופר Nephotettix cincticeps הנגוע בנגיף ננס האורז (RDV) משמש כדוגמה. ויטלוגנין וחלבון הקפסיד החיצוני העיקרי P8 של RDV וקטור על ידי הרוק של N. cincticeps ניתן לזהות בו זמנית בצמח האורז כי N. cincticeps ניזון ממנו . שיטה זו ישימה לבדיקת חלבוני הרוק הנשמרים באופן זמני בצמח המארח לאחר הזנת חרקים. הוא האמין כי מערכת זו של זיהוי יועיל המחקר של hemipteran-virus-צמח או hemipteran-צמח אינטראקציות.
Introduction
מצב השידור הווקטורי-מארח של ארבו-וירוסים, בעיה בסיסית, נמצא בחזית המדע הביולוגי. וירוסים צמחיים רבים בעלי חשיבות חקלאית מועברים אופקית על ידי וקטורים של חרקים1. יותר ממחצית הנגיפים הצמחיים הם וקטורים על ידי חרקים המיפטרניים, כולל כנימות, זבובים לבנים, עלים, פלנטהופרים ותריפס. לחרקים אלה תכונות ייחודיות המאפשרות להם להעביר ביעילות וירוסים צמחיים1. יש להם חלקי פה מוצצי פירסינג והם ניזונים מהלשד מפלואם ומקסילם, ומפרישים את הרוק שלהם 1,2,3,4. עם הפיתוח והשיפור של טכניקות, הזיהוי והניתוחים הפונקציונליים של מרכיבי הרוק הופכים למוקד חדש של מחקר אינטנסיבי. חלבוני הרוק הידועים ברוק כוללים אנזימים רבים, כגון פקטינאסטראז, צלולאז, פרוקסידאז, פוספטאז אלקליין, פוליפנול אוקסידאז וסוכראז, בין היתר 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . החלבונים ברוק כוללים גם אליקטורים המפעילים את תגובת ההגנה של הפונדקאי, ובכך משנים את ביצועי החרקים, ומשפיעים המדכאים את הגנת הפונדקאי, המשפרים את כושר החרקים ורכיבים הגורמים לתגובות פתולוגיות של המארח14,15,16,17. לכן, חלבוני רוק הם חומרים חיוניים לתקשורת בין חרקים לפונדקאים. במהלך העברת הנגיפים, הרוק המופרש על ידי בלוטות הרוק של חרקים אלימים מוצצי פירסינג מכיל גם חלבונים נגיפיים. רכיבים נגיפיים מנצלים את זרימת הרוק כדי לשחרר אותם מהחרק לפונדקאי הצמח. לכן, רוק החרק מגשר על האינטראקציה הטריטרופית וירוס-וקטור-מארח. חקירת התפקוד הביולוגי של חלבוני רוק המופרשים על ידי חרקים אלימים מסייעת להבין את הקשר בין וירוס-וקטור-מארח.
עבור וירוסים של בעלי חיים, מדווח כי רוק של יתושים מתווך את ההעברה והפתוגניות של נגיף הנילוס המערבי (WNV) ונגיף דנגי (DENV). חלבון הרוק AaSG34 מקדם שכפול והעברה של נגיף דנגי-2, ואילו חלבון הרוק AaVA-1 מקדם העברת נגיף DENV וזיקה (ZIKV) על ידי הפעלת אוטופגיה18,19. חלבון הרוק D7 של יתושים יכול לעכב זיהום DENV במבחנה ו-in vivo באמצעות אינטראקציה ישירה עם נגיפים של DENV וחלבון מעטפת DENVרקומביננטי 20. בנגיפים צמחיים, וירוס תלתלי העלים הצהובים של עגבנייה (TYLCV) גורם לחלבון הרוק של הזבוב הלבן Bsp9, המדכא את החסינות בתיווך WRKY33 של מארח הצמח, להגביר את ההעדפה והביצועים של הזבובים הלבנים, ובסופו של דבר מגביר את העברת הנגיפים21. מאחר שמחקרים על התפקיד שממלאים חלבוני רוק של חרקים בפונדקאים של צמחים פיגרו אחרי אלה של פונדקאים של בעלי חיים, נדרשת בדחיפות מערכת יציבה ואמינה לזיהוי חלבוני הרוק בפונדקאים של צמחים.
נגיף הצמח המכונה וירוס ננס אורז (RDV) מועבר על ידי הופר Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) ביעילות גבוהה ובאופן מתפשט מתמשך22,23. RDV דווח לראשונה כמועבר על ידי וקטור חרקים וגורם למחלה קשה של אורז באסיה24,25. הנגיף הוא איקוסהדרלי ודו-שכבתי כדורי, והשכבה החיצונית מכילה את חלבון הקפסיד החיצוני P822. תקופת השידור במחזור הדם של RDV ב N. cincticeps היא 14 ימים 26,27,28,29,30. כאשר RDV מגיע לבלוטות הרוק, נגיפים משתחררים לחללים המאוחסנים ברוק בבלוטות הרוק באמצעות מנגנון דמוי אקסוציטוזה23. ויטלוגנין (Vg) הוא קודמן חלבון החלמון החיוני להתפתחות ביציות בנקבות חרקים31,32,33. לרוב מיני החרקים יש לפחות תעתיק Vg אחד של 6-7 קילובייט, המקודד חלבון מקדים של כ-220 kDa. מבשרי החלבון של Vg יכולים בדרך כלל להיבקע למקטעים גדולים (140 עד 190 kDa) וקטנים (<50 kDa) לפני הכניסה לשחלה18,19. ניתוח פרוטאומי קודם גילה את נוכחותם של הפפטידים שמקורם ב-Vg ברוק המופרש של העלה Recilia dorsalis, אם כי תפקידם אינו ידוע (נתונים שלא פורסמו). לאחרונה דווח כי Vg, המופרש דרך הפה מצמחים, מתפקד כגורם משפיע לפגיעה בהגנות של צמחים34. לא ידוע אם Vg של N. cincticeps יכול גם להשתחרר לצמח המארח עם זרימת רוק, ואז יכול לשחק תפקיד בצמח להפריע להגנה על הצמח. כדי לענות על השאלה האם N. cincticeps מנצל חלבוני רוק, כגון Vg, כדי לעכב או להפעיל את הגנות הצמח, הצעד הראשון הוא זיהוי חלבונים המשתחררים לצמח במהלך ההאכלה. הבנת השיטה לזיהוי חלבוני הרוק הנמצאים בצמח עשויה להיות חיונית כדי להסביר את תפקודם של חלבוני הרוק ואת יחסי הגומלין בין המיפטרה לצמחים.
בפרוטוקול המוצג כאן, N. cincticeps משמש כדוגמה כדי לספק שיטה לבחון את נוכחותם של חלבוני רוק בצמח המארח שהוכנסו באמצעות הזנת חרקים. הפרוטוקול מפרט בעיקר את האיסוף והזיהוי של חלבוני רוק והוא מועיל לחקירה נוספת על רוב ההמיפטרנים.
Protocol
Representative Results
Discussion
הרוק המופרש ישירות על ידי בלוטות הרוק של החרקים המוצצים ממלא תפקיד מרכזי מכיוון שהוא מעכל מראש ומנקה רעלים מהרקמות המארחות ומהגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות של הווקטורים לפונדקאים 1,3,4. הגורמים הביולוגיים חוצי הממלכות, כולל אליציטורים, ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (31772124 ו -31972239) ואוניברסיטת פוג’יאן לחקלאות וייעור (מענק KSYLX014).
Materials
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J., Resh, V. H., Carde, R. T. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. , (2003).
- Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps. Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).
- Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae). Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).
- Miles, P. W. Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds. Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).
- Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. Phenol oxidising enzymes in the grain aphid’s saliva. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).
- Miles, P. W., Peng, Z. Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids. Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).
- Will, T., van Bel, A. Physical and chemical interactions between aphids and plants. Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).
- Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments. Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).
- Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid. Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).
- Funk, C. J. Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva. Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant-insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment. Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).
- Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. , (2018).
- Hogenhout, S. A., Bos, J. I. Effector proteins that modulate plant–insect interactions. Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).
- Sun, P., et al. A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy. Nature Communications. 11 (1), 260 (2020).
- Sri-In, C., et al. A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181 (2019).
- Conway, M. J., et al. Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection. Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941 (2016).
- Wang, N., et al. A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313 (2019).
- Omura, T., Yan, J. Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors. Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).
- Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus. Frontiers in Microbiology. 12, 639445 (2021).
- Fukushi, T. Further studies on the dwarf disease of rice plant. Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).
- Miyazaki, N., et al. The functional organization of the internal components of rice dwarf virus. Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).
- Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes. Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).
- Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector. Virology Journal. 12, 211 (2015).
- Chen, Q., et al. Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector. Virus Research. 210, 54-61 (2015).
- Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector. Scientific Reports. 7, 38563 (2017).
- Wei, T., et al. The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures. Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).
- Mao, Q., et al. Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development. mBio. 11 (6), 01142 (2020).
- Tufail, M., Takeda, M. Molecular characteristics of insect vitellogenins. Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).
- Sappington, T. W., Raikhel, A. S. Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).
- Ji, R., et al. Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses. New Phytologist. , (2021).
