Påvisning av virus- og spyttproteiner av en bladhoppervektor i planteverten

Summary

Denne protokollen demonstrerer hvordan man bruker planteverten til å oppdage spyttproteiner av bladhopper og plantevirale proteiner frigjort av bladhoppervektorer.

Abstract

Insektvektorer overfører horisontalt mange plantevirus av landbruksmessig betydning. Mer enn halvparten av plantevirus overføres av hemipteran insekter som har piercing-sugende munndeler. Under viral overføring bygger insektspyttet bro over virusvektorverten fordi spyttvektorvirusene og insektproteinene utløser eller undertrykker immunresponsen til planter fra insekter til planteverter. Identifisering og funksjonelle analyser av spyttproteiner blir et nytt fokusområde i forskningsfeltet arbovirus-vert interaksjoner. Denne protokollen gir et system for å oppdage proteiner i spytt av bladhoppere ved hjelp av planteverten. Bladhoppervektoren Nephotettix cincticeps infisert med risdvergvirus (RDV) tjener som et eksempel. Vitellogenin og hoved ytre kapsidprotein P8 av RDV vektorert av spytt av N. cincticeps kan detekteres samtidig i risplanten som N. cincticeps spiser på . Denne metoden er anvendelig for testing av spyttproteiner som holdes forbigående i planteverten etter insektfôring. Det antas at dette deteksjonssystemet vil være til nytte for studiet av hemipteran-virus-plante- eller hemipteran-planteinteraksjoner.

Introduction

Vektor-vert overføringsmodus for arbovirus, et grunnleggende problem, er på grensen til biologisk vitenskap. Mange plantevirus av landbruksmessig betydning overføres horisontalt av insektvektorer¹. Mer enn halvparten av plantevirus er vektorert av hemipteran insekter, inkludert bladlus, hvitefugler, bladhopper, plantehoppere og thrips. Disse insektene har forskjellige egenskaper som gjør at de effektivt kan overføre plantevirus¹. De har piercing-sugende munndeler og spiser på saften fra floem og xylem, og skiller ut spyttet 1,2,3,4. Med utvikling og forbedring av teknikker blir identifisering og funksjonelle analyser av spyttkomponenter et nytt fokus for intensiv forskning. De kjente spyttproteinene i spytt inkluderer mange enzymer, som pektinesterase, cellulase, peroksidase, alkalisk fosfatase, polyfenoloksidase og sukrase, blant annet 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Proteinene i spytt inkluderer også elicitors som utløser vertsforsvarsresponsen, og dermed endrer ytelsen til insekter, og effektorer som undertrykker vertsforsvaret, noe som forbedrer insektkondisjon og komponenter som induserer vertspatologiske responser^14,15,16,17. Derfor er spyttproteiner viktige materialer for kommunikasjon mellom insekter og verter. Under overføring av virus inneholder spytt utskilt av spyttkjertlene av piercing-sugende viruliferous insekter også viruliferous proteiner. Virale komponenter utnytter spyttstrømmen for å frigjøre dem fra insektet til planteverten. Derfor bygger insektspyttet bro over virus-vektor-vert tritrofisk interaksjon. Undersøkelse av den biologiske funksjonen til spyttproteiner utskilt av viruliferous insekter bidrar til å forstå forholdet mellom virus-vektor-vert.

For dyrevirus er det rapportert at spytt av mygg medierer overføring og patogenicitet av West Nile virus (WNV) og Dengue virus (DENV). Spyttproteinet AaSG34 fremmer dengue-2-virusreplikasjon og overføring, mens spyttproteinet AaVA-1 fremmer overføring av DENV og Zika-virus (ZIKV) ved å aktivere autofagi^18,19. Myggens spyttprotein D7 kan hemme DENV-infeksjon in vitro og in vivo via direkte interaksjon med DENV-virionene og det rekombinante DENV-konvoluttproteinet²⁰. I plantevirus induserer begomovirustomatgult bladkrøllvirus (TYLCV) hvitefuglspyttproteinet Bsp9, som undertrykker den WRKY33-medierte immuniteten til planteverten, for å øke preferansen og ytelsen til hvite fluer, og til slutt øke overføringen av virus²¹. Fordi studier av rollen som insektspyttproteiner spiller i planteverter, har ligget bak dyrevertene, er det nødvendig med et stabilt og pålitelig system for å oppdage spyttproteiner i planteverter.

Planteviruset kjent som risdvergvirus (RDV) overføres av bladhopperen Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) med høy effektivitet og på en vedvarende forplantende måte^22,23. RDV ble først rapportert å bli overført av en insektvektor og forårsaker en alvorlig sykdom av ris i Asia^24,25. Virionen er icosahedral og dobbeltlags sfærisk, og det ytre laget inneholder P8 ytre kapsidprotein²². Den sirkulative overføringsperioden for RDV i N. cincticeps er 14 dager 26,27,28,29,30. Når RDV kommer til spyttkjertler, frigjøres virioner i spyttlagrede hulrom i spyttkjertlene via en eksocytoselignende mekanisme²³. Vitellogenin (Vg) er eggeplommeproteinforløperen som er essensiell for oocyttutvikling hos kvinnelige insekter^31,32,33. De fleste insektarter har minst ett Vg-transkript på 6-7 kb, som koder for et forløperprotein på ca. 220 kDa. Proteinforløperne til Vg kan vanligvis spaltes i store (140 til 190 kDa) og små (<50 kDa) fragmenter før de går inn i eggstokken^18,19. Tidligere proteomiske analyser avslørte tilstedeværelsen av peptidene avledet fra Vg i det utskilte spyttet til bladhopperen Recilia dorsalis, selv om deres funksjon er ukjent (upubliserte data). Det er nylig rapportert at Vg, som er muntlig utskilt fra plantehoppere, fungerer som en effektor for å skade plantenes forsvar³⁴. Det er ukjent om Vg av N. cincticeps også kunne frigjøres til planteverten med spyttstrøm, og deretter kunne spille en rolle i planten for å forstyrre planteforsvaret. For å adressere om N. cincticeps utnytter spyttproteiner, som Vg, for å hemme eller aktivere planteforsvar, er det første trinnet å identifisere proteiner som frigjøres til planten under fôring. Å forstå metoden for å identifisere spyttproteinene som er tilstede i planten er potensielt viktig for å forklare spyttproteinets funksjon og samspillet mellom Hemiptera og planter.

I protokollen som presenteres her, brukes N. cincticeps som et eksempel for å gi en metode for å undersøke tilstedeværelsen av spyttproteiner i planteverten introdusert gjennom insektfôring. Protokollen beskriver primært innsamling og påvisning av spyttproteiner og er nyttig for videre undersøkelse på de fleste hemipteraner.

Protocol

De ikke-viruliferøse voksne bladhopperne ble forplantet i Vector-borne Virus Research Center i Fujian Agriculture and Forestry University, Kina. 1. Ikke-viruliferous insektoppdrett Bak de voksne på risplanter i et kubebur som er 40 cm x 35 cm x 20 cm (lengde x bredde x høyde). Hold den ene siden av buret dekket med et insektsikkert nett for ventilasjon.Hold burene med bladhoppere i en inkubator som inneholder en innebygd fuktighetsregulator ved 26 °C med en relativ fuktig…

Representative Results

Figur 1 illustrerer alle trinnene i denne protokollen: insektoppdrett, virusoppkjøp, innsamling av spyttproteiner via risfôring og western blot. De vestlige blottresultatene viste at spesifikke og forventede bånd på ca. 220 kDa ble observert i prøvene av fôring av ris og spyttkjertler av insekter på membranen inkubert med antistoffer mot Vg. Derimot ble det ikke observert noe bånd i risprøven uten fôring. Resultatet i figur 2 …

Discussion

Spyttet som utskilles direkte av spyttkjertlene til de piercingsugende insektene, spiller en sentral rolle fordi det fordøyer og avgifter vertsvevet og vektorenes biologiske faktorer på tvers av kongeriketⁱ vertene ^1,3,4. De biologiske faktorene på tvers av riket, inkludert elicitorer, effektorer og lite RNA, er kritiske for insekt-vertkommunikasjon^14,15,16…

Materials

Reagents
Tris base	Roche	D609K69032	For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5×Tris-glycine buffer preparation
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5×Tris-glycine buffer preparation
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10×TBS buffer preparation
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10×TBS buffer preparation
ß-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4× protein sample buffer preparation
bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4× protein sample buffer preparation
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4× protein sample buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
Buffers and Solutions
Buffer	Composition		Comments/Description
5×Tris-glycine buffer	15.1 g Tris base 94 g glycine  5 g SDS in 1 L sterile water		Stock solution
1×Tris-glycine buffer	200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water		Work solution, for SDS-PAGE
10×Tris-buffered saline (TBS) buffer	80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water		Stock solution
TBS with Tween 20 (TBST) solution	100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water		Work solution
4× protein sample buffer	8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8)		For protein extraction
Transfer buffer	800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol		For protein transfer
Instruments
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	SHBL3668	For 4x protein sample buffer preparation
Constant temperature incubator	Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.	PRX-1200B	For rearing leafhoppers
Electrophoresis	Tanon Science & Technology Co.,Ltd.	Tanon EP300	For SDS-PAGE
Electrophoretic transfer core module	BIO-RAD	1703935	For SDS-PAGE
glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	For 4x protein sample buffer preparation
glycine	Sigma-Aldrich	WXBD0677V	For 5x Tris-glycine buffer preparation
goat anti-rabbit IgG	Sangon Biotech	D110058-0001	Recognization of the primary andtibody
High-pass tissue grinding instrument	Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.	JXFSIPRP-24	For grinding plant tissues
KCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10016318	For 10x TBS buffer preparation
methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10014118	For transfer buffer preparation
Mini wet heat transfer trough	BIO-RAD	1703930	For SDS-PAGE
NaCl	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd	10019318	For 10x TBS buffer preparation
nitrocellulose membrane	Pall Corporation	25312915	For proteins transfer
non-fat dry milk	Becton.Dickinso and company	252038	For membrane blocking, antibodies dilution
Pierce ECL Western kit	ThermoFisher Scientific	32209	Chemiluminescent substrate
Protein color instrument	GE Healthcare bio-sciences AB	Amersham lmager 600	For detecting proteins
SDS	Sigma-Aldrich	SLCB4394	For 5x Tris-glycine buffer preparation
Tris base	Roche	D609K69032	For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation
Tween 20	Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY	CT30111220	For TBST preparation
Vertical plate electrophoresis tank	BIO-RAD	1658001	For SDS-PAGE
Water bath	Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd.	XMTD-8222	For boil the protein samples
β-mercaptoethanol	Xiya Reagent	B14492	For 4x protein sample buffer preparation